الزخرفة مطروح السريع لطبقات الخلايا الحية مع التحقيق ميكروفلويديك

الأساسي من الطريقة المعروضة في مقالة الفيديو هذه هو توليد أنماط خلايا محددة مكانيا بسرعة لتسهيل التحليل الزماني المكاني للتفاعلات من خلية إلى خلية. تستفيد الاستراتيجية المقدمة من تقنية مسبار الموائع الدقيقة. يقوم رأس المسبار الدقيق بتوطين أحجام نانولتر من المواد الكيميائية الحيوية على ركائز بيولوجية لنمط الطبقات الأحادية للخلايا.

تتمثل الميزة الرئيسية لتقنية الزخرفة القائمة على MFP في أنها فورية تقريبا ، بسبب التحلل المحلي ، مما يسمح بتعديل الأنماط في الوقت الفعلي. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما لاحظنا أن الطرق الأخرى لإنشاء أنماط الخلايا تتطلب بروتوكولات طويلة ومتعددة الخطوات قبل أن نرى بالفعل نجاح أنماط الخلايا. لإجراء تجارب مستقرة مع حبس التدفق الهيدروديناميكي على سطح الخلية ، يجب تحسين معلمات MFP.

لهذا الغرض ، يعد العرض المرئي أمرا بالغ الأهمية. سيوضح أديتيا كاشياب وجوليان كورس هذا الإجراء. تتكون الوحدات التشغيلية للمنصة من محاقن آلية ومراحل آلية ووحدة تحكم.

يتم توصيل MFP بمرحلة Z آلية للتحكم في مسافة الفجوة بين الرأس والركيزة ، ويتم توصيل حامل الركيزة بالمرحلتين الآلية X و Y التي تشكل نظام المسح. يحتوي رأس MFP على فتحات سائلة للاتصال بمحطة الضخ ، وفتحات تثبيت لتركيب الرأس على المرحلة Z ، والقنوات التي تخرج من القمة المصقولة. يتم تعيين القمة بشكل متزامن على ركيزة زراعة الخلية.

لإعداد محطة الضخ وجهاز مناولة السوائل ، قم بتنظيف المحاقن وغطاسات الحقن عن طريق الصوتنة ومحلول التبييض بنسبة 0.5٪ في المياه عالية النقاء قبل تجارب الخلايا الحية وبعدها. اشطفها جيدا بالماء. املأ المحاقن بالماء عن طريق غمر أطرافها بالكامل في حمام مائي والشفط باستخدام المكبس.

قم بتطهير السائل أثناء وجوده داخل الحمام المائي مع اتصال عمود المحقنة بالختم عند مخرج المحقنة. استمر في الشفط والتطهير حتى لا تظهر فقاعات هواء في أعمدة المحقنة. قم بتوصيل المحاقن المملوءة بمضخات الحقن باستخدام موصلات القفل السفلي.

استخدم صمام التبديل المثبت على المضخات لتوجيه السائل من المحقنة إلى أحد الشعيرات الدموية المؤدية إما إلى رأس الطابعة متعددة الوظائف أو إلى خزانات السائل. قم بتطهير كلا الشعيرات الدموية بالماء من المحاقن بمعدل تدفق حوالي 10 إلى 50 ميكرولتر في الدقيقة ، اعتمادا على حجم المحقنة ، حتى يترك حوالي 10 ميكرولتر من الماء في المحاقن. قم بتنظيف رأس MFP عن طريق الصوتنة باستخدام منظف الأواني الزجاجية للتنظيف القياسي ، أو 0.5٪ مبيض للتنظيف الصارم ، لمدة خمس دقائق.

قم بتطهير القنوات بالماء عن طريق غمر القمة في الماء وتطبيق فراغ على الفتحات. افحص القنوات تحت مجهر استريو بحثا عن العوائق المحتملة ، وكرر الخطوة السابقة ، إذا لزم الأمر. بعد ذلك ، قم بتركيب الرأس الذي تم تنظيفه على حامل الرأس وقم بربط الموصل على الرأس.

أدخل الشعيرات الدموية التي تم تطهيرها في محول موصل الموائع الدقيقة المناسب الذي يتفاعل مع فتحات القناة في الرأس. قم بربط حامل الرأس بالمرحلة Z ، والتي تستخدم للتحكم في مسافة الفجوة بين الرأس والطبقة الأحادية للخلية ، قبل إجراء معايرة نقطة النهاية كما هو موضح في بروتوكول النص. احصل على مسافة خام صفرية الفجوة عن طريق إحضار رأس MFP فوق شريحة غرفة بدون خلايا والنزول ببطء في خطوات خمسة ميكرون.

عند ملامسة المسبار للركيزة ، يجب ملاحظة حلقات نيوتن. هذا تقدير أولي. يجب الحصول على موضع دقيق بعد ضبط السطح المشترك لقمة المسبار على الركيزة.

عند تشكيلها ، تأكد من أن حلقات نيوتن متماثلة. لضمان تطابق قمة المسبار ، اضبط إمالة الرأس باستخدام مقياس الزوايا في واجهة الرأس والمرحلة Z. حرك رأس الطابعة متعددة الوظائف 20 ميكرون بعيدا عن الركيزة واضبط الإمالة باستخدام مقياس الزوايا.

كرر ضبط الهبوط والتصفير والإمالة حتى تصبح حلقات نيوتن متماثلة عند التلامس. مع ضبط الإمالة ، اضبط الموضع Z ، الذي ينتج حلقات نيوتن متماثلة ، عند الصفر. بعد ذلك ، قم بإعداد سائل المعالجة لقناة الحقن الداخلية ومحلول الاستخراج العازل المطلوب للحقن الخارجي ، كما هو موضح في بروتوكول النص.

باستخدام خط التصريف ، قم بتوصيله بمضخات الحقن ، وقم بتطهير الماء المتبقي وشفط المحاليل المنزوعة الغاز في محاقن الحقن بسرعة 40 ميكرولتر في الدقيقة حتى تمتلئ المحاقن. هذا يضمن ملء المحاقن والموصلات والشعيرات الدموية بدون فقاعات. لتحضير الطبقات الأحادية للخلية على شرائح الغرفة ، قم بإنفاق الخلايا في قوارير T باستخدام بروتوكولات زراعة الخلايا القياسية.

عند الوصول إلى التقاء الخلايا في قوارير الثقافة ، قم بالتربسين وجمع الخلايا. قم ببذور 0.2 مليون خلية لكل سنتيمتر مربع في كل شريحة من الشرائح المكونة من غرفتين للزخرفة. استزراع الخلايا على مدار 48 ساعة باستخدام الخلايا الموجودة في إحدى الغرف كعنصر تحكم في نمو الخلايا وقابليتها للحياة.

عند الوصول إلى التقاء الخلية على شرائح الغرفة ، احتضان الخلايا لمدة 45 دقيقة مع 500 ميكرولتر من محلول صبغة تعقب الخلايا بتركيز 10 ميكرومولار محضر في وسط خال من المصل. يتم ذلك لتصور الخلية أثناء الزخرفة. اغسل الخلايا الملصقة باستخدام PBS عن طريق شطف كل حجرة برفق باستخدام ماصة.

بعد ذلك ، قم بزراعة الخلايا في وسط مكمل بالمصل لتجارب الزخرفة. يقوم حبس التدفق الهيدروديناميكي بتحديد موقع السوائل باستخدام الحقن المتزامن وشفط سائل المعالجة. في الحبس الهرمي ، يتم حصر سوائل معالجة متعددة ، حيث يحمي مركبات الكربون الهيدروفلورية الخارجية العينة من مركبات الكربون الهيدروفلورية الداخلية للمعالجة.

حرك الطابعة متعددة الوظائف فوق الطبقة الأحادية للخلية إلى مسافة فجوة تبلغ 50 ميكرون من الشريحة الزجاجية. تضمن مسافة الفجوة هذه ملامسة مركبات الكربون الهيدروفلورية الهرمية وتأخذ أيضا في الحسبان تباين سطح وسمك طبقة واحدة. حقن هيدروكسيد الصوديوم بمعدل ستة أو ثمانية ميكرولتر في الدقيقة من خلال I-two.

تقييم معدلات التدفق الأخرى باستخدام قواعد التدفق في بروتوكول النص. قم بتعديل حجم مركبات الكربون الهيدروفلورية الداخلية عن طريق تغيير نسبة معدلات تدفق الحقن QI-two و QI-one باستخدام محاقن الحقن. على سبيل المثال ، استخدم QI-one بين 1.3 ميكرولتر في الدقيقة وأربعة ميكرولتر في الدقيقة ، مع تثبيت QI-two بثمانية ميكرولتر في الدقيقة ، لينتج عنه بصمة هيدروكسيد الصوديوم من 150 إلى 300 خلية.

بحقن وسط كامل من الفتحات الخارجية على رأس الطابعة متعددة الوظائف بمعدل تدفق يبلغ 20 ميكرولتر في الدقيقة لحساب تبخر الوسط والشفط أثناء تشغيل مركبات الكربون الهيدروفلورية. لتصميم الطبقات الأحادية للخلية ، اضبط برنامج المسرح لمسح رأس المسبار فوق الطبقة الأحادية للخلية في أنماط يحددها المستخدم بسرعة مسح تبلغ 10 ميكرون في الثانية ومسافة فجوة تبلغ 50 ميكرون. مع تشغيل مركبات الكربون الهيدروفلورية المتداخلة وملامسة للطبقة الأحادية ، قم بمسح الطابعة متعددة الوظائف بمسار النمط المطلوب للتأثير على إزالة الخلايا المنقوشة.

للحصول على زراعة مشتركة بعد الإزالة الأولى من نوع الخلية ، قم بزرع خط خلوي مختلف لملء الفجوات ، كما كان من قبل. إعداد محطة أخذ العينات لتحليل المصب للمحللة. يظهر هنا مثال على محطة أخذ العينات ، والتي تتألف من حامل PCR مطبوع ثلاثي الأبعاد من ثمانية شرائط.

امسح حامل الأنبوب بنسبة 70٪ من الإيثانول أو غيره من الملوثات السطحية ، بناء على الصرامة المطلوبة للتطبيق. استخدم مشبك مغناطيسي على حامل الأنبوب لتثبيته على حامل الركيزة. بعد تحضير محطة أخذ العينات ، ضع رأس MFP على بعد 100 ميكرون من الطبقة الأحادية.

ابدأ تشغيل مركبات الكربون الهيدروفلورية بمحلول هيدروكسيد الصوديوم 50 ملليمولار كسائل معالجة لقناة الحقن الداخلية بمعدل تدفق ميكرولتر واحد في الدقيقة ل QI-واحد ، وستة ميكرولتر في الدقيقة ل QI-two ، وناقص سبعة ميكرولتر في الدقيقة ل QA-one ، وناقص 17.5 ميكرولتر في الدقيقة ل QA-two. بمجرد استقرار حبس التدفق ، أنزل رأس المسبار إلى مسافة فجوة تبلغ 50 ميكرون لإجراء التحلل الموضعي القائم على هيدروكسيد الصوديوم في المجموعة الفرعية المختارة من الخلايا مع مركبات الكربون الهيدروفلورية. بمجرد اكتمال تحلل السكان الفرعيين ، قم بتوجيه الرأس نحو الأنابيب في محطة أخذ العينات.

اخرج المحللة المجمعة في أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل مباشرة. بعد معالجة المحللة ، كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بتحميل المحللة في سير عمل qPCR قياسي كما هو محدد من قبل مورد الأداة. من خلال التحكم في نسبة سوائل الحقن في مركبات الكربون الهيدروفلورية الهرمية ، يتم تعديل حجم البصمة الملامسة لسطح الخلية.

تم اختيار معدلات التدفق ، بحيث يكون التأثير الكيميائي ، بدلا من القص ، هو الآلية المهيمنة لتحلل الخلية. تم تأكيد ذلك من خلال تحديد القص باستخدام ديناميكيات الموائع الحسابية. يظهر هنا إنشاء شبكة من جزر الخلايا عن طريق مسح برمجة المسار باستخدام MFP.

تعديل حجم البصمة باستخدام نسبة سائل الحقن بالتحكم في دقة إزالة الخلية. يمكن استخدام هذه الطريقة للزراعة المشتركة المتسلسلة لمجموعات الخلايا المتعددة ، وبالتالي توليد أنماط معقدة من التفاعلات من خلية إلى أخرى. إن استخدام هيدروكسيد الصوديوم كسائل معالجة يجعل المحللة متوافقة مع التحليل القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل للخلايا.

هنا ، تم قياس محتوى الحمض النووي من خمسة وواحد بصمة ، باستخدام الطريقة الموصوفة. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية على الخلايا في أقل من 30 دقيقة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التأكد من خلو القنوات والشعيرات الدموية من فقاعات الهواء ، لأن هذا قد يؤثر سلبا على مركبات الكربون الهيدروفلورية.

لا تنس أن العمل باستخدام هيدروكسيد الصوديوم ، وهو محلول كيميائي مسبب للتآكل ، يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل نظارات السلامة ومعاطف المختبر أثناء تنفيذ هذا الإجراء. باتباع هذا الإجراء ، يمكننا تحليل الخلايا محليا عن طريق التلوين المناعي أو تسلسل الحمض النووي الريبي عن طريق التحلل بوساطة MFP من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل البروتينات التي يتم التعبير عنها بشكل مفرط بسبب الحبس الهندسي للخلايا. بعد تطويرها ، يمكن لهذه التقنية أن تمهد الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا الجزيئية لاستكشاف الإشارات بين الخلايا وخارجها أثناء توليد الأنسجة وتنكسها.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصميم الطبقات الأحادية للخلايا التي تم إعدادها في MFP للمعالجة المحلية وعمل أشكال هندسية معقدة للزراعة المشتركة للخلايا.