الكمي الزمانية التعبير MAPK المستحثة في خلايا الخميرة واحدة

الهدف العام من التجربة التالية هو قياس تعبير البروتين المنشط بالميتوجين على مستوى الخلية الواحدة. ولتحقيق ذلك، تم استنباط سلالة من الخميرة تحمل مراسل التعبير الفلوري quadruple Venus الذي يتم التحكم فيه بواسطة المحفز STL one وهو خاص بتنشيط map kinase hog one. يمكن قياس تعبير البروتين الفلوري إما عن طريق مقايسة مجهرية للخلايا الحية حيث يتم تعريض الخلايا للإجهاد مباشرة تحت المجهر لتسهيل ظهور الفلورة في الوقت الفعلي، أو عن طريق قياس التدفق الخلوي (flow cytometry)، وفي هذه الحالة يتم تعريض الخلايا للإجهاد في أنبوب دقيق ويتم وقف تخليق البروتين في وقت محدد.

من خلال إضافة cyclo heximide، يمكن تحليل عدد قليل فقط من الخلايا في كل مرة باستخدام مجهر الخلايا الحية، ولكن يمكن ملاحظة مصير الخلايا الفردية مباشرة وربط ذلك بخصائص خلوية أخرى. ومن ناحية أخرى، يتيح قياس التدفق الخلوي تقييم تعبير البروتين المنشط بالميتوجين في أعداد كبيرة من الخلايا في آن واحد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال التأشير الخلوي، مثل تحديد البروتينات المشاركة في تنظيم التعبير الجيني. ومع أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول مسار الخميرة، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على شلالات تأشير أخرى اعتماداً على توفر المراسل التعبيري المناسب.

لتحضير الخلايا للفحص المجهري للخلايا الحية، ابدأ بتلقيح خمسة ملليلترات من الوسط الاصطناعي بالخميرة، ثم قم بتنمية الخلايا عند 30 °C طوال الليل. وفي صباح اليوم التالي، قم بقياس OD 600 للمزرعة التي نمت طوال الليل، ثم خفف هذه المزرعة في خمسة ملليلترات من الوسط الاصطناعي حتى تصل قيمة OD 600 إلى 0.05. قم بتنمية المزرعة المخففة عند 30 °C لمدة أربع ساعات إضافية على الأقل.

بعد ذلك، قم بترشيح حوالي 200 µL من محلول con a المُحضّر حديثاً في شريحة البئر. بعد مرور 30 دقيقة، قم بإزالة محلول con a وأضف 150 µL من الماء إلى البئر. الآن، قم بإزالة الماء واترك البئر ليجف بينما يتم تحضير الخلايا.

قم بقياس الكثافة الضوئية OD 600 للمزرعة الخلوية مرة أخرى، ثم خفف الخلايا للحصول على 300 µL من المزرعة الخلوية بكثافة ضوئية OD 600 تبلغ 0.02 في أنبوب دقيق سعة 1.5 mL. قم بمعالجة الخلايا بالموجات فوق الصوتية في حمام مائي لمدة 45 ثانية. قم برج الأنابيب الدقيقة بسرعة باستخدام جهاز الفورتيكس، ثم كرر عملية المعالجة بالموجات فوق الصوتية والرج مرة أخرى.

أضف الآن 200 µL من الخلايا إلى شريحة الآبار، وبعد ترك الخلايا تترسب في قاع البئر لمدة 30 دقيقة تقريباً، ضع الشريحة على المجهر. بعد ذلك، اختر إعدادات الإضاءة للقناة الفلورية المراد تسجيلها ولصورتين بالمجال المضيء، مع ضبط أحد إعدادات المجال المضيء على مسافة 3 µm تقريباً أسفل المستوى البؤري للسماح بتقسيم الخلايا بشكل صحيح. ثم حدد الفواصل الزمنية لقياسات التصوير الزمني (time lapse) واختر مجالات الرؤية للتصوير.

ابدأ الآن عملية الاستحواذ لبضعة إطارات، ثم أوقف الاستحواذ مؤقتاً لإضافة 100 µL من وسط كلوريد الصوديوم 0.6 M المحضر حديثاً، واستأنف التصوير لتحضير الخلايا للقياس بواسطة قياس التدفق الخلوي. ابدأ بتلقيح الخميرة في خمسة ملليلترات من الوسط الاصطناعي وزرع الخلايا طوال الليل عند 30 °C. في صباح اليوم التالي، قم بقياس OD 600 للمزرعة التي نمت طوال الليل، ثم خفف معلق الخلايا في خمسة ملليلترات من الوسط الاصطناعي حتى تصل قيمة OD 600 إلى 0.1.

قم بتنمية المزرعة لمدة أربع ساعات على الأقل عند درجة حرارة 30 °C للوصول إلى كثافة ضوئية OD 600 تتراوح بين 0.2 و 0.4. بعد ذلك، أضف 100 µL من كلوريد الصوديوم بتركيز 0.6 molar المحضر حديثاً إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 mL لكل نقطة زمنية سيتم قياسها عند الزمن صفر. أضف 200 µL من الخلايا إلى كل أنبوب دقيق واحضن المزارع مع الرج عند درجة حرارة 30 °C.

بعد ذلك، وفي كل نقطة زمنية تجريبية، أضف 30 µL من cyclo heide المُحضّر حديثاً إلى أحد الأنابيب الدقيقة. وأثناء حضانة الأنابيب الدقيقة، أضف 400 µL من PBS إلى أنبوب fax مطابق لكل أنبوب دقيق. وبعد انتهاء الحضانة، قم برج الأنابيب الدقيقة سريعاً باستخدام جهاز vortex، ثم قم بإجراء عملية السونكة (sonication) للخلايا في حمام مائي لمدة دقيقة واحدة كما تم توضيحه للتو.

ثم أضف 100 µL من المزرعة الخلوية من كل أنبوب دقيق إلى أنبوب الفاكس المقابل له في جهاز قياس التدفق الخلوي. قم بتحميل إعدادات الإثارة والكشف المناسبة واختبر العينات غير المعبرة والعينات ذات التعبير الكامل للتحقق من وقوعها ضمن نطاق حساسية الكاشف. وأخيراً، قم بقياس 10,000 خلية لكل عينة في هذه الصور، حيث تم تحفيز خلايا الخميرة التي تحمل مراسل التعبير البروتين الوريدي الرباعي تحت تحكم محفز TL one والمرتبطة بقاع شريحة الآبار عن طريق الإضافة المباشرة لوسط الإجهاد.

كما تم توضيحه للتو، تمت مراقبة الخلايا لمدة ساعتين تقريباً على فترات زمنية مدتها 10 دقائق، وتم الحصول على الصور قبل وبعد إضافة المحفز. لاحظ التعبير الفلوري للمراسل خلال الخلايا المنشطة. ولاستخراج المعلومات الكمية الواردة في هذه الصور، يجب إجراء عملية تحليل صور معقدة هنا.

تظهر النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام منصة تحليل كمية الخميرة. يمثل كل أثر أحمر التطور الزمني لمتوسط شدة الفلورة لخلية واحدة. ويوضح الخط الأزرق الوسيط لأكثر من 500 خلية تم تقسيمها وتتبعها عبر 20 إطاراً من خمسة أفلام تصوير زمني تم الحصول عليها من خمسة حقول رؤية مختلفة من نفس البئر، بينما تمثل المنطقة الزرقاء الفاتحة المئين 25 و75 لجميع الشدات المقاسة عند نقطة زمنية معينة. ولدراسة ديناميكيات التعبير عن نفس المراسل بواسطة قياس التدفق الخلوي، تمت إضافة Cycloheximide إلى مزارع خلايا الخميرة في نقاط زمنية مختلفة بفواصل زمنية تتراوح من 5 إلى 10 دقائق.

يمنع هذا العقار تخليق بروتينات جديدة، ولكن نضج البروتين الفلوري الذي تم التعبير عنه بالفعل لا يتأثر. وبناءً على ذلك، يمكن قياس التعبير البروتيني الذي تم تصورُه من خلال إزاحة المخطط التكراري (histogram) إلى اليمين في وقت إضافة Cycl H، مما يتجاوز المشكلات المرتبطة بنضج البروتين الفلوري. وفي هذا الرسم البياني، تتم مقارنة ديناميكيات مراسل التعبير (expression reporter) كما تم قياسها بواسطة المجهر أو قياس التدفق الخلوي؛ فبينما تزداد الإشارة الفلورية بعد 30 إلى 40 دقيقة من إضافة وسط الإجهاد وفقاً لقياسات المجهر، تشير قياسات التدفق الخلوي بوضوح إلى أن البروتينات قد أُنتجت بالفعل في غضون 10 إلى 15 دقيقة بعد التحفيز، مما يثبت النضج البطيء للبروتينات الفلورية.

تسمح كلتا التقنيتين بالوصول إلى معلومات الخلية الواحدة في هذه التجارب البسيطة، كما أن التباين بين ثلاث مكررات بيولوجية يكون ضئيلاً مقارنة بالتباين الكبير الملحوظ في استجابات الخلية الواحدة عن طريق المجهر أو قياس التدفق الخلوي. وبعد اتباع هذه الإجراءات، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل قياسات الاستجابة المذكورة للإجابة على أسئلة إضافية، مثل تحديد عتبة التعبير الجيني. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس التعبير البروتيني على مستوى الخلية الواحدة باستخدام المجهر أو قياس التدفق الخلوي.