نظام الثقافة 3D على أساس إدراج تصفية السريع لالبروستاتا الابتدائية تمايز الخلايا

هنا ، نقدم طريقة لإنشاء نظام سريع في المختبر يدعم الزراعة ثلاثية الأبعاد والتمايز اللمعي اللاحق لخلايا البروستاتا الظهارية الأولية.

الهدف العام من نظام الثقافة ثلاثية الأبعاد القائم على إدراج المرشح للخلايا الأولية المشتقة من المريض هو إنشاء نظام نموذج مختبري أكثر صلة بيولوجيا لأبحاث سرطان البروستاتا. باستخدام الخلايا البشرية الأولية ، يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في بيولوجيا نمو البروستاتا وكذلك في سرطان البروستاتا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها منهجية سريعة نسبيا في المختبر لإنشاء خلايا البروستاتا الأولية المتمايزة والتي تسمح أيضا بالعزل السريع للجزيئات الحيوية مثل الحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتين.

يعد العرض المرئي لهذه الطرق أمرا بالغ الأهمية لأن معالجة الخلايا على إدراج المرشح للأنسجة أو للحمض النووي الريبي وجمع البروتين دقيقة وحساسة للوقت. للمساعدة في الحد من الانتشار بين الغرف في خزانة السلامة البيولوجية ، ضع طبقة رقيقة من 0.1٪ جيلاتين على الجانب السفلي من الإدخالات واتركها تجف. كرر هذا الإجراء مرتين أخريين.

ثم ضع الخلايا على الغرفة الداخلية للإدخالات المطلية بالجيلاتين وزرعها لمدة تصل إلى أسبوعين. بعد أسبوعين ، قم بتطبيق إدخالات المرشاح المزروعة مباشرة على أحد التطبيقات النهائية المناسبة المفصلة في ما يلي. لبدء هذا الإجراء ، قم بشفط PBS من الغرفة الخارجية وقم بإزالة PBS بعناية من الغرفة الداخلية.

يمكن الاحتفاظ بالإدخالات المستنبتة لفترة وجيزة في PBS حتى يصبح التطبيق جاهزا للبدء ولكن لا تسمح للغشاء بالجفاف. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من 0.25٪ Trypsin EDTA إلى كل غرفة داخلية. ثم احتضنها لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، كشط الخلايا على سطح الغشاء لفترة وجيزة وبعناية باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر أثناء سحب العينات لأعلى ولأسفل. ثم احتضنها لمدة دقيقة واحدة عند 37 درجة مئوية. بعد دقيقة واحدة، أضف 250 ميكرولترا من الوسائط المكيفة إلى الغرفة الداخلية الأولى وقم برفع الماصة لأعلى ولأسفل برفق لشطف الفلتر.

بعد هذا ، قم بنقل الخلايا المعلقة إلى غرفة الترشيح المجاورة التي تحتوي على نفس ظروف الوسائط وتكرار سحب العينات لأعلى ولأسفل. كرر هذا الإجراء لكل إدخالات من حالة واحدة. ثم اجمع الخلايا وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل.

اشطف كل غرفة داخلية ب 100 إلى 200 ميكرولتر إضافية من الوسائط المكيفة لجمع أي خلايا متبقية وإضافتها إلى أنبوب الطرد المركزي سعة 1.5 مل. بعد ذلك ، قم بتدوير الخلايا في جهاز طرد مركزي دقيق عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بشفط المادة الطافية واغسل حبيبات الخلية مرة واحدة باستخدام 1 ، 000 ميكرولتر من PBS.

قم بتدوير الخلايا مرة أخرى في جهاز طرد مركزي دقيق عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. بعد خمس دقائق ، قم بشفط PBS وتجميد العينة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لاستخدامها لاحقا. في هذا الإجراء ، أضف 200 ميكرولتر من غوانيدينيوم أو ثيوسيانات أو فينول أو كلوروفورم أو كاشف استخراج مماثل إلى الغرفة الداخلية وقم بتحريك الخلايا على سطح الغشاء لفترة وجيزة عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.

ثم احتضان الخلايا في كاشف الاستخراج لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة واترك الغرفة الخارجية جافة. بعد ذلك ، اغسل غشاء المرشح عن طريق سحب محلول الاستخراج لأعلى ولأسفل. اجمع أكبر قدر ممكن من كاشف الاستخراج عن طريق إمالة لوحة الآبار الستة وشفط أي سائل متبقي.

يرجى ملاحظة أن المرشح قد ينفصل عن الملحق. اغسل غشاء المرشح المنفصل إذا كان متصلا. ثم اجمع أكبر قدر ممكن من كاشف الاستخراج واتبع بروتوكول الشركة المصنعة لتنقية واستعادة الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو البروتين.

يجب توخي الحذر عند غسل الخلايا والتصفية باستخدام ثيوسيانات الجوانيدينيوم لأن التحريض المفرط يمكن أن ينتج عنه RNA رديء الجودة. من أجل عزل البروتين عن ملحق المرشح ، ضع ملحق المرشح في لوحة الآبار الستة على الجليد. ثم أضف 10 ميكرولتر من محلول تحلل البروتين إلى الغرفة الداخلية.

حرك الخلايا الموجودة على سطح الغشاء وكشطها باستخدام ماصة سعة 20 ميكرولتر أثناء سحب العينات لأعلى ولأسفل وتجنب توليد فقاعات في مخزن التحلل. بعد ذلك ، احتضان صفيحة الآبار الستة مع إدراج المرشح على الجليد لمدة عشر دقائق. كرر الكشط ثم اشطف سطح الغشاء باستخدام عازلة التحلل.

اجمع المحللات من الإدخالات الستة وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل على الجليد. بعد ذلك ، اشطف الغشاء الأول ب 10 ميكرولتر إضافي من محلول التحلل وانقله إلى المرشح التالي. كرر هذا الإجراء لجميع إدخالات حالة تجريبية معينة ، وجمع أي محلول عازل للتحلل المتبقي وأضفه إلى أنبوب 1.5 ملليلتر.

احتضان العينة على الجليد لمدة خمس دقائق إضافية. ثم قم بتدويرها بأقصى سرعة لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. عند الانتهاء ، قم بتحويل الماصة إلى أنبوب جديد 1.5 ملم.

ثم انتقل إلى تحليل تركيز البروتين أو قم بتخزين المحللات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. في هذا الإجراء ، أضف 500 ميكرولتر ومليلتر واحد من 10٪ NBF إلى الغرفة الداخلية والخارجية على التوالي. احتضنها طوال الليل عند أربع درجات مئوية.

في اليوم التالي ، قم بشفط NBF من الغرفة الخارجية وأضف ملليلترا واحدا من هلام معالجة HEA إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر. قم بإذابة الاغاروز ببطء في الميكروويف باستخدام طاقة منخفضة وكرر النبضات لمدة 10 ثوان حتى يذوب الاغاروز. احتفظ ب HEA في حمام دافئ بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمنع التصلب حتى يصبح جاهزا للاستخدام.

بعد ذلك ، قم بإزالة NBF من الغرفة الداخلية. ضع 25 ميكرولترا من HEA المنصهر على الغرفة الداخلية واترك الاغاروز يتجمد لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق. ثم بلل وسادتين من الأنسجة الرغوية في 10٪ NBF وضع وسادة واحدة في كاسيت التضمين.

الحفاظ على سلامة طبقات الخلية على ملحق المرشح باستخدام HistoGel خطوة حاسمة للحفاظ على طبقة الخلية السليمة للتقسيم النسيجي. بعد ذلك ، استخدم مشرط الشفرة رقم 11 لتسجيل المرشح من الجانب السفلي من حجرة الإدخال البلاستيكية ، وتحريره جزئيا. ضع 100-200 ميكرولتر من NBF في طبق بتري واغمر الفلتر الذي تم إزاحته جزئيا في NBF.

باستخدام مشرط شفرة رقم 10 ، اضغط برفق على منتصف المرشح من داخل حجرة الإدخال لإخراج المرشح بالكامل من أسطوانة الإدخال. إذا كان هناك أي جزء من الفلتر لا يزال متصلا بالبرميل ، فقم بقطعه بالمشرط. بعد ذلك قطع المرشح المطلي ب HEA إلى النصف.

ضع كل نصف من الفلتر على وسادة الرغوة في كاسيت الأنسجة المجهز. ثم أضف الإسفنجة الثانية المنقوعة بنسبة 10٪ NBF إلى الكاسيت ، مع وضع الفلتر. بعد ذلك ، قم بإغلاق الكاسيت.

ضعه في NBF واحتضنه طوال الليل. تظهر صورة المجال الساطع هذه طبقات خلوية متعددة الطبقات أعلى الغشاء المسامي. يتم عرض الصور الفلورية الفردية للنوى و P63 ومستقبلات الأندروجين ، وكذلك دمج جميع علامات التألق الثلاثة.

أخيرا ، يتم عرض مجال ساطع مركب وتراكب تألق مناعي ، مما يحدد توطين إشارة الفلورسنت بالنسبة للخلايا والمرشح. تظهر هنا صورة مقطعية لإدراج المرشح الخاص بنا ، مقارنة بالطبقات الظهارية القنوية للبروستاتا السليمة. بمجرد إتقان هذه التقنية ، يمكن القيام بها في غضون أسبوعين مع العزل النهائي للخلايا وإدخال المرشح أو الجزيء الحيوي المطلوب ، والذي يستغرق أقل من 30 دقيقة إذا تم إجراؤه بشكل صحيح.

أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر دائما توخي الحذر عند العمل مع إدخالات المرشح ، حتى لا يحدث أي ضرر لطبقة الخلية أو المرشح الأساسي. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل البقع الغربية والمصفوفة الدقيقة للحمض النووي الريبي وتحليلات البروتيوم من أجل الإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بتحليل المسار والخلايا السرطانية. ستساعد هذه التقنية في تمهيد الطريق للباحثين في مجال سرطان البروستاتا لاستكشاف بيولوجيا البروستاتا بشكل أفضل بالإضافة إلى أسس سرطان البروستاتا باستخدام خلايا البروستاتا الأولية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم ممتاز لكيفية إعداد واستعادة خلايا البروستاتا الأولية المزروعة بشكل صحيح من نظام الثقافة ثلاثي الأبعاد هذا.