تقييم قدره التمايز من الخلايا الظهاريه البروستاتا الماوس باستخدام الثقافة Organoid

الفئران البروستاتا العضوية تمثل سياق واعده لتقييم أليات التي تنظم التمايز. تصف هذه الورقة نهجا محسنا لإنشاء organoids البروستاتا ، ويقدم أساليب ل (1) جمع البروتين محلله من organoids ، و (2) الإصلاح والهيكل التنظيمي وصمه عار لكامل جبل المجهر البؤري.

ويعتبر الجهاز العضوي ثلاثي الأبعاد أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية من المقايسات 2D، ويمكن أن توفر معلومات قيمة حول علم الأحياء التي من شأنها أن تكون خلاف ذلك تحديا للحصول على. هذا هو نظام قابل للتكيف حيث يمكننا اختبار التلاعب الدوائية والجينية مع وقت أقل وتكلفة أقل بكثير من استخدام نهج في الجسم الحي. محاكمة مصفوفة صعبة جدا للتعامل معها، كما أنه يقوي عندما يصل إلى درجة حرارة الغرفة.

لا يمكن رسمها إلا من خلال ماصة عندما تكون سائلة ويجب الحفاظ عليها على الجليد. سلامة الحلبة من المهم الحفاظ عليها. إذا تم تعطيل الهيكل ، يمكن أن يؤثر ذلك سلبًا على نمو الجهاز العضوي ، ويمكنك بسهولة فقدان المواد عند تغيير الوسائط.

ابدأ هذا الإجراء مع إعداد الخلايا الظهارية للماوس وبوثة البروستاتا على النحو المبين في بروتوكول النص. غسل بيليه الخلية في 500 ميكرولترات من وسائل الإعلام الماوس organoid، ثم إعادة تعليق بيليه في كثافة الخلية من 1، 000 خلية لكل ميكرولتر. لإعداد خلطات رئيسية، خلط الخلايا الظهارية علقت في وسائل الإعلام الماوس الأعضاء مع هلام مصفوفة لتوليد الخليط النهائي الذي يحتوي على 25٪ الخلايا في وسائل الإعلام و 75٪ هلام مصفوفة.

اعتمادا على تطبيق المصب، وعادة ما مطلي الخلايا القاعدية بتركيز من 100 إلى 2،000 الخلايا لكل 80 ميكرولترات، في حين مطلي الخلايا الإنارة بتركيز 2، 000 إلى 10، 000 خلية لكل 80 ميكرولترات. لكل خليط الخلية، إضافة 80 ميكرولترات من هلام مصفوفة لكل بئر من لوحة 24-جيدا. الماصات قطرة على النصف السفلي من جدار البئر مع تجنب الاتصال المباشر مع طلاء بولي هيما.

بعد إضافة هلام المصفوفة، دوامة لوحة للسماح لخليط الخلية هلام مصفوفة لتشكيل حلقة حول حافة البئر. ضع لوحة 24-well في 37 درجة مئوية، 5٪ C02 حاضنة الجانب الأيمن حتى لمدة 10 دقائق للسماح هلام مصفوفة لتصلب جزئيا. بعد احتضان لمدة 10 دقائق، الوجه لوحة 24 جيدا رأسا على عقب واحتضان لمدة 50 دقيقة إضافية للسماح هلام مصفوفة لتصلب تماما.

ثم، إضافة 350 microliters من قبل الدافئة الماوس organoid وسائل الإعلام قطرة الحكمة إلى مركز كل بئر. بعد إضافة وسائل الإعلام، والعودة لوحة 24-جيدا إلى الحاضنة. لتجديد وسائل الإعلام الماوس organoid، إمالة لوحة 24-جيدا في زاوية 45 درجة، وإزالة بلطف الوسائط الموجودة من وسط كل بئر باستخدام ماصة P1000 مع تجنب حلقة هلام مصفوفة.

إضافة 350 microliters من وسائل الإعلام organoid الماوس قبل الدافئة كما كان من قبل. من المستحسن إضافة حجم أكبر من الوسائط إلى organoids المستزرعة لأكثر من خمسة أيام لمنع الاستنفاد السريع للمغذيات الرئيسية وعوامل النمو. إزالة الوسائط من كل جيدا كما قبل.

لجمع organoids، انفجار مرارا وتكرارا هلام مصفوفة عن طريق pipetting ملليلتر واحد من وسائل الإعلام التي تحتوي على ما قبل الدافئة dispase مباشرة على حلقة هلام مصفوفة حتى يتم طرد الحلقة بأكملها. نقل خليط المصفوفة هلام organoid إلى أنبوب 1.5 ملليلتر جهاز طرد مركزي صغير. بعد الهضم الكامل كما هو موضح في بروتوكول النص، إضافة المالحة الفوسفات المخزنة على بيليه organoid، وإعادة تعليق عن طريق الخفقان بلطف.

بيليه organoids عن طريق الطرد المركزي في 800 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإزالة سوبرنات باستخدام ماصة صغيرة. إعادة تعليق الكريات العضوية في 100 ميكرولترات من تحلل البروتين العازلة لكل 10 ميكرولترات من حجم الخلية معبأة. قم بالتمرير السريع لإعادة الإيقاف.

الآن، sonicate organoids عن طريق غمر أنابيب في الجليد الرطب وتطبيق بلطف غيض من dismembrator سونيك إلى خارج أنبوب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة. سونيكات لمدة 40 ثانية في 20 كيلوهيرتز قبل الشروع في النشاف الغربية مع البروتوكولات المعمول بها. لجمع الأعضاء البروستاتا من لوحات 24-جيدا، وإزالة وسائل الإعلام من كل جيدا كما كان من قبل.

استوعب هلام المصفوفة عن طريق احتضان 500 ميكرولترات من الوسائط المحتوية على dispase لمدة 30 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون. جمع تعليق العضوية هضم في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير. ثم، بيليه organoids عن طريق الطرد المركزي في 800 مرة G لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإزالة supernatant.

لأداء كامل جبل تلوين المناعة من organoids البروستاتا، أولا إضافة 500 ميكرولترات من 4٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني. احتضان الأعضاء لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف. بعد غسل بيليه كما هو موضح في بروتوكول النص، إضافة ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من وصمة عار DAPI في حل منع، واحتضان لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.

حماية العينة من الضوء أثناء الحضانة من هذه الخطوة إلى الأمام. بعد الطرد المركزي من organoids كما كان من قبل، إضافة الأجسام المضادة الأولية في منع الحل واحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية مع اهتزاز لطيف. بيليه organoids مرة أخرى، وغسل بيليه مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز لطيف.

كرر هذا الإجراء غسل مرتين. ثم إضافة الأجسام المضادة الثانوية في حل حجب، واحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية مع اهتزاز لطيف. بعد الحضانة، بيليه organoids، وغسل بيليه لمدة مرتين إضافية.

إضافة ملليلتر واحد من 30٪ السكروز في برنامج تلفزيوني مع 1٪ تريتون X-100 إلى organoids بيليه. ثم احتضان لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف. بعد ثني organoids مرة أخرى، إضافة ملليمتر واحد من 45٪ السكروز في برنامج تلفزيوني مع 1٪ تريتون X-100، ويهز بلطف لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.

ثم, كرر الإجراء, باستثناء إضافة ملليلتر واحد من 60٪ سكروز في برنامج تلفزيوني مع 1٪ تريتون X-100. بيليه organoids عن طريق الطرد المركزي في 800 مرات G لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإزالة 95٪ من عظمى. مراقبة بيليه تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية للتأكد من أنه لم يفقد أثناء إزالة من افر.

بيليه يصبح أكثر مرونة كما تركيز السكروز يصبح أعلى. نقل 10 إلى 20 ميكرولترات من التعليق المتبقي إلى غطاء غرفة، والمضي قدما في المجهر confocal. الخلايا القاعدية واللممعة تشكيل organoids مع morphologies متميزة.

في حين أن معظم الأعضاء المشتقة من القاعد متشابهة في الحجم بعد سبعة أيام في الثقافة ، فإن organoids المشتقة من اللمعان تظهر عدم تجانس كبير. وعلاوة على ذلك، فإن معظم الأعضاء المشتقة من القاعدات القاعدية تحتوي على تجويفات محاطة بظهارة متعددة الطبقات، في حين أن العضيات المشتقة من اللمعان تتراوح في مورفولوجيا من جوفاء مع ظهارة أحادية الطبقات إلى صلبة مع أسلاك متعددة الطبقات من الخلايا التي لا تتقن القناة. وكشف تحليل البقعة الغربية أن organoids القاعدية واللمعية المشتقة من اللون اللمعاني تحتفظ بميزات مرتبطة بالخلايا الأساسية والأساسية.

تعبر الأعضاء المشتقة من القاعدية عن مستويات أعلى من السيتوكيراتين 5 العلامة القاعدية، في حين تعبر الأعضاء المشتقة من اللمعان عن مستويات أعلى من سيتوكيراتين العلامة الإنارةية 8. تم الكشف عن كل من علامات القاعدية واللمعان في العضيات المشتقة من القاعات القاعدية واللمعانية في مجموعات السكان السائبة ، وربما توحي بالتمايز. تحتوي العضيات المشتقة من القاعد على ظهارة متعددة الطبقات، مع طبقات خارجية تعبر عن مستويات عالية من علامة القاعدية p63، والطبقات الداخلية التي لها مستويات غير قابلة للكشف.

الطبقات الخارجية أيضا التعبير عن مستويات معتدلة من cytokeratin علامة اللمبينة 8، والطبقات الداخلية لديها مستويات عالية. في حين أن جميع الخلايا في طبقة واحدة من الأعضاء المشتقة من اللمعان تلطخ بشكل إيجابي للسيتوكيراتين 8 ، إلا أن الخلايا المختارة تحتوي على p63 النووية. يجب توخي الحذر عند التعامل مع هلام المصفوفة للتأكد من أنه لا تصلب قبل الطلاء الخلايا في ثقافة organoid.

يمكن أن يسبب DAPI المستخدمة في المجهر تهيج الجلد. كما يمكن أن يكون ضوء الأشعة فوق البنفسجية ضارًا. ومن الضروري توفير معدات حماية شخصية كافية.

يمكننا جمع الحمض النووي الريبي من organoids لأداء تسلسل الحمض النووي الريبي، والتي سوف تخبرنا عن كيفية تغير ملامح التعبير الجيني خلال تشكيل organoid أو ردا على التلاعب. وقد مكن هذا النموذج مجال البروستاتا أن يكون مستنسخ ex vivo مقايسة لدراسة الجوانب الأساسية للبيولوجيا الظهارية وتحديد المنظمين في التنمية والتمايز.