A استخراج الدهون وتحليل طريقة لتوصيف ميكروبات التربة في تجارب مع العديد من العينات

الهدف من هذا الفيديو هو وصف طريقة تزيد من الإنتاجية مع موازنة الجهد والدقة لاستخراج الدهون من أغشية الخلايا للكائنات الحية الدقيقة لاستخدامها في توصيف كل من الدهون الكلية والوفرة النسبية لدهون المؤشر لتحديد بنية المجتمع الميكروبي للتربة والدراسات مع العديد من العينات. في هذا المجال ، يجب أن تأخذ في الاعتبار عدم تجانس التربة في جمع عينات التربة بطريقة تمثل موقعك. للحفاظ على المجتمع الميكروبي في وقت أخذ العينات ، يجب نقل العينات من الحقل على الجليد.

بمجرد العودة إلى المختبر ، قم بإزالة الجذور والحجارة وتفتيت الكتل عن طريق الغربلة الخشنة. يعمل هذا أيضا على تجانس عينتك. استعد للتجفيف بالتجميد عن طريق وضع عينات فرعية في حاويات مناسبة وتجفيفها بالتجميد في أسرع وقت ممكن.

بمجرد تجفيف التربة بالتجميد ، قم بتخزينها في وعاء مغلق مع مجفف حتى الاستخراج. من الأفضل تخزين التربة المجففة في المجمد على حرارة 80 درجة C.As التحضير للاستخراج ، وإزالة التربة المجففة بالتجميد من التخزين وطحنها. تشمل طرق الطحن مطحنة الكرة أو عداد الكرة أو الملاط والمدقة.

بعد طحن التربة ، مرة أخرى ، قم بتجانس عينات التربة جيدا وتخزينها في الفريزر. يجب أن تكون جميع أدوات المختبر نظيفة بدقة. يمكن أن يؤثر أي منظف أو شحوم أو أوساخ متبقية على النتائج من خلال الظهور كذروة في كروماتوجرام GC النهائي.

تتم عمليات الاستخراج في أنابيب طرد مركزي من التفلون سعة 30 مليلتر ، والتي يجب شطفها بالمذيبات. أضف ملليلترين إلى ثلاثة ملليلترات من الهكسان إلى الأنابيب والدوامة لبضع ثوان. صب الهكسان إلى أنبوب آخر ودوامة.

يمكن استخدام ملليلترين إلى ثلاثة ملليلترات من الهكسان لشطف ستة أنابيب بشكل متسلسل. قم بتخزين أنابيب الهكسان المغسولة رأسا على عقب في غطاء الدخان وتخلص من الهكسان المستخدم في حاوية نفايات مناسبة. يمكن كتم الأواني الزجاجية أو شطفها بالمذيب مباشرة قبل الاستخدام.

يضمن كتم الصوت نظافة الأواني الزجاجية عن طريق أكسدة المخلفات عند درجة حرارة عالية. لف الأواني الزجاجية في طبقتين إلى ثلاث طبقات من رقائق الألومنيوم وضعها في فرن دثر. اضبطه على 450 درجة مئوية ، وبمجرد أن يصل الفرن إلى نقطة الضبط ، اخبز لمدة 4 1/2 ساعات على الأقل.

اترك ساعة واحدة على الأقل للتبريد قبل إخراجها من الفرن. قم بتسمية ووزن أنابيب التفلون المغسولة بالهكسان. أضف التربة إلى أنابيب الطرد المركزي من التفلون وأعد وزنها لكتلة التربة.

قم دائما بعمل فراغين على الأقل لكل دفعة وقم بتضمين معيار فحص ، ويفضل أن تكون تربة تم استخراجها مسبقا ، إذا كنت تريد التحقق من أن الاستخراج يعمل بشكل صحيح. استخراج الدهون. قم بإعداد ثلاث ماصات من خمسة إلى 10 ملليلتر لمخزن الفوسفات والكلوروفورم والميثانول.

الكلوروفورم هو سائل كثيف للغاية له توتر سطحي منخفض. كن حذرا من أن الكمية التي توزعها دقيقة ومتسقة. احتفظ بالزجاجة نصفها على الأقل ممتلئة بالسائل.

في غطاء الدخان ، أضف الكواشف إلى التربة في أنبوب التفلون بالترتيب التالي ، عازلة الفوسفات ، الكلوروفورم ، والميثانول. هذا هو أول استخراج مادي للدهون من عينة المواد الخاصة بك. يتم تضمين وصفات حلول الكاشف في البروتوكول المكتوب.

تعتبر نسب المذيبات وترتيب الإضافة مهمة للفصل الصحيح للمرحلتين العضوية والمائية. اترك التربة وقتا لتتبلل بعد إضافة المخزن المؤقت قبل إضافة الكلوروفورم. إذا كان ذلك مناسبا ، يمكن دمج المستخلصات وإضافتها كحصة واحدة للاستخلاص الثاني وأي عمليات استخراج لاحقة.

قم بتغطية أنابيب التفلون بإحكام وقم بتغطيتها للحماية من الضوء. ضعها على الخلاط أفقيا مع التأكد من أنها مؤمنة جيدا. مع ضبط سرعة عالية ، رج العبوة لمدة ساعة.

أثناء اهتزاز الأنابيب ، قم بإعداد أنبوبين زجاجيين طويلين لكل عينة على النحو التالي. قم بتسمية الأنبوب ، وأضف نفس حجم الكلوروفورم الذي تمت إضافته إلى التربة وحجم متساو من مخزن الفوسفات. بعد إزالة أنابيب التفلون من شاكر عند 25 درجة مئوية ، قم بالطرد المركزي للأنابيب لمدة 10 دقائق عند 2 ، 500 دورة في الدقيقة.

ثم ، في غطاء الدخان مع إطفاء الأضواء ، قم بصب المادة الطافية من أنبوب التفلون إلى أحد الأنابيب الطويلة. يجب أن يكون فصل الطور مرئيا في الأنبوب الزجاجي. تحتوي الطبقة السفلية على المذيب العضوي ، والكلوروفورم بشكل أساسي ، والدهون.

يتكرر هذا الاستخراج. صب المادة الطافية في الأنبوب الثاني الذي تم إعداده مسبقا. الآن قمت باستخراج الدهون جسديا من التربة مرتين.

بالنسبة لمعظم أنواع التربة ، هذا كاف. قم بتغطية جميع الأنابيب ذات الفئة الطويلة بإحكام بأغطية مبطنة بالتفلون واقلبها 10 مرات للخلط. افصل المراحل عن طريق الجاذبية بين عشية وضحاها.

اسمح للعينات بالوقوف دون إزعاج طوال الليل لإكمال فصل المرحلتين. للقيام بذلك ، احتفظ بالعينات في خزانة مظلمة أو مغطاة بورق الألمنيوم في درجة حرارة الغرفة. لا بأس في السماح للمقتطفات بالانفصال خلال عطلة نهاية الأسبوع.

اليوم الثاني ، عزل الدهون. في اليوم الثاني ، يتم شفط الطبقة المائية وتركيز الدهون عن طريق إزالة المذيب في نظام التبخر الفراغي. يمكن أيضا تجفيف العينات عن طريق وضعها في حمام مائي أو رملي وتطبيق تيار لطيف من النيتروجين.

يجب الآن فصل السائل الموجود في الأنابيب جيدا ونقيا إلى حد كبير. إذا لم يكن الأمر كذلك ، أو إذا كانت الواجهة بين الطبقتين سميكة بشكل خاص ، فاترك الفصل يستمر ليوم آخر. قم بإعداد شفاط فراغ في الغطاء.

هذه قارورة ذراع جانبية متصلة بمضخة تفريغ مع أنبوب Tygon ورقي وماصة المراعي. أثناء تشغيل المضخة ، استخدم الماصة لسحب الطور المائي إلى القارورة. استنشق الطبقة العليا والواجهة.

سيكون هذا حوالي 2/3 من الطريق لأسفل. افعل ذلك مع مجموعتين إلى ثلاث مجموعات من الأنابيب الزجاجية. قد تحتوي الطبقة العليا على جزيئات قليلة من التربة.

قم بإزالتها إن أمكن. اجمع بين المستخلص من المجموعة الثانية و / أو الثالثة من الأنابيب مع تلك الموجودة في الأولين عن طريق الصب بعناية. حاول استبعاد أي مادة صلبة من صب أي مادة صلبة وشطف جدران الأنبوب عن طريق الدوران.

استخدم ماصة نظيفة لكل عينة وكرر هذه العملية للعينات المتبقية. بمجرد دمج مستخلصات الكلوروفورم والبقاء لبضع دقائق ، افحص سطح السائل. في كثير من الأحيان ، تتشكل طبقة رقيقة من الماء المتبقي.

إذا كان هذا موجودا ، فقم بالاستنشاق قبل المتابعة. قد يهاجم الماء المتبقي الروابط المزدوجة للأحماض الدهنية ، ولكن يجب أن تتبخر كمية صغيرة جدا مع المذيبات أثناء تجفيف العينات. جفف جميع العينات باستخدام جهاز التبخر الفراغي.

قم بتغطية الأنابيب بإحكام وتخزينها في الفريزر عند 80 درجة مئوية.اليوم الثالث ، التصبن والمثيلة. أولا ، قم بتشغيل الحمامات المائية. تحقق من مستوى الماء واضبط الحمام على 95 درجة مئوية والاستحمام من اثنين إلى 80 درجة مئوية ، باستخدام إعادة ماصة ، أضف ملليلترا واحدا من كاشف التصبن ، الكاشف 1 ، إلى الدهون المجففة.

غطيها بإحكام ، ودوامة لفترة وجيزة ، وضعيها على الرف. بمجرد النزول في هذه الخطوة ، ضع رف الأنابيب في حمام مائي بدرجة حرارة 95 درجة مئوية وانتظر خمس دقائق. قم بإزالة رف الأنابيب من الحمام وفحص الأنابيب بحثا عن التسريبات.

سيشار إلى ذلك من خلال الفقاعات التي ترتفع في الأنبوب مثل الرغوة. أعد شد أو استبدال أغطية الأنابيب المتسربة. استمر في تسخين الأنابيب في الحمام المائي لمدة 10 دقائق أخرى.

قلل درجة الحرارة في الحمام المائي إلى 80 درجة مئوية واستمر في الحضانة لمدة 15 دقيقة أخرى. قم بإزالة الأنابيب وتبرد عن طريق وضع الرف في قدر من ماء الصنبور. لا تستخدم الماء المثلج.

بمجرد أن تبرد العينات ، أضف ملليلترين من كاشف المثيلة ، الكاشف 2 ، إلى كل عينة. مرة أخرى ، قم بالغطاء بإحكام والدوامة لمدة خمس إلى 10 ثوان. قد تصبح الأملاح الحبيبية مرئية كمترسب في المحلول ، وهو ما يحدث أحيانا بسبب الكواشف الزائدة.

ضع الرف في حمام مائي 80 درجة مئوية واحتضنه لمدة 10 دقائق. قم بإزالة رف الأنابيب من الحمام المائي وضعه في قدر من ماء الصنبور للتبريد. حرك الحامل لتسريع عملية التبريد.

باستخدام إعادة الماصة ، أضف 1.25 مل من الهكسان وميثيل إيثر بوتيل ثلاثي ، الكاشف 3 ، إلى كل أنبوب لاستخراج الطور. أغلق الأغطية بإحكام وضع الأنابيب على شاكر لمدة 10 دقائق. بعد الاهتزاز ، اترك رف الأنابيب يجلس لمدة 10 دقائق حتى تنفصل المراحل.

انقل المرحلة العضوية ، التي أصبحت الآن الطبقة العليا ، إلى أنبوب زجاجي قصير باستخدام ماصة المراعي. من الأفضل استعادة معظم السائل. كميات صغيرة جدا من المرحلة المائية لن تضر بالاستخراج.

كرر استخراج الطور المائي عن طريق إضافة الكاشف 3 ، والاهتزاز ، والسماح للمراحل بالانفصال ، ونقل المرحلة العليا. اعتمادا على حالة المرحلة السفلية ، يمكنك تكرار هذا مرة أخرى ليصبح المجموع ثلاث عمليات نقل. أضف 3 ملليلتر من الغسيل الأساسي ، الكاشف 4 ، وهو محلول مخفف من هيدروكسيد الصوديوم ، إلى المستخلصات الموجودة في الأنابيب القصيرة.

قم بتغطية أنابيب الاختبار بإحكام والدوامة لمدة 20 إلى 30 ثانية ثم جهاز الطرد المركزي لمدة ثلاث دقائق عند 2,000 دورة في الدقيقة. بمجرد الطرد المركزي، باستخدام ماصة المراعي النظيفة، استنشق الطور العضوي العلوي ونقلها إلى قارورة كهرمانية سعة أربعة ملليلتر. احرص على عدم شفط أي من المرحلة المائية.

الخطوة التالية هي تبخير المذيب حتى يجف في جهاز التبخر الفراغي. اليوم الرابع ، تحضير المستخلصات لتحليل GC. باستخدام الماصة ، أضف 100 ميكرولتر من الكاشف 3 إلى كل من قوارير 4 ملليلتر التي تحتوي على المرحلة المجففة.

دوامة العينة ثم اتركها تقف لمدة 10 دقائق. باستخدام الماصة الثانية ، انقل FAMEs المعلقة بعناية إلى قارورة GC. أضف كمية أخرى من المذيب إلى قارورة أربعة ملليلتر والدوامة لفترة وجيزة.

قم بلف القارورة للتأكد من إذابة الشهرة المتبقية على جدران القارورة. باستخدام الماصة الثانية مرة أخرى ، انقل المذيب إلى قارورة GC. أكمل النقل عن طريق إضافة حصة ثالثة من المذيب إلى القارورة ، والدوامة ، ونقلها إلى قارورة GC.

قم بتغطية قارورة GC وتخزينها في الفريزر. قم بتخزين قوارير GC محكمة الغلق في الفريزر قبل التحليل. تحليل GC.

لاستخدام هذا النظام ، يجب إجراء التحليل باستخدام عمود GC محدد. تم تجهيز كروماتوجراف الغاز بمدخل غير قابل للانقسام مزود ببطانة مدخل زجاجية بحجم أربعة ملليمترات مع قابس من الصوف الزجاجي غير المنشط. تم ضبط المدخل على 250 درجة مئوية ويتم تشغيله في وضع الضغط الثابت.

الغاز الناقل هو الهيدروجين. هناك حاجة إلى النيتروجين والهواء كغازات داعمة للكاشف. يتم استخدام عمود Agilent Ultra 2.

طول العمود 25 مترا وقطره الداخلي 2 ملم وسمك فيلم طور ثابت 33 ميكرومتر. المرحلة الثابتة في هذا العمود هي 5٪ فينيل ، 95٪ ميثيل بولي سيلوكسان ، المعروف أيضا باسم عمود نوع DB-5. لتحليل المستخلصات الدهنية ، يتم حقن كمية ميكرولتر بنسبة انقسام 100: 1 مع درجة حرارة الفرن عند 170 درجة C.Post الحقن ، تمت برمجة الفرن لزيادة خمس درجات في الدقيقة حتى 300 درجة مئوية ثم الاحتفاظ بها لمدة 12 دقيقة.

يتم إجراء سلسلة من الحقن لمعيار MIDI وتستخدم النتائج لإجراء تعديلات وفقا للتعليمات الواردة في دليل MIDI. بمجرد معايرة النظام بهذه الطريقة ، قد يحتاج النظام إلى تعديلات طفيفة في بعض الأحيان ، ولكن يجب أن يحقق بشكل عام نتائج جيدة باستخدام هذه المعلمات. ينتج نظام MIDI تقريرا لكل عينة يحتوي على جدول يحتوي على سطر واحد لكل ذروة محققة.

يبلغ البرنامج عن وقت الذروة للاستبقاء ، ومنطقة الذروة ، وتحديد الذروة ، جنبا إلى جنب مع ECL أو طول السلسلة المقدر ، والمعلمة المستخدمة لتحديد الذروة ، وعامل الاستجابة ، وهي معلمة تستخدم لتطبيع الاختلافات واستجابة الكاشف فيما يتعلق بوقت الاستبقاء. يعبر ECL عن المكان الذي ينبعث منه كل FAME غير معروف من بين سلسلة من السلسلة المستقيمة. على سبيل المثال ، إذا كان وقت الاحتفاظ بمجهول يميء في منتصف الطريق بين تلك الخاصة بسلسلة كربون 12 و 13 ، يتم الإبلاغ عن ECL على أنه سلسلة كربون 12.5.

يقارن البرنامج خسائر الائتمان المتوقعة لكل ذروة بتلك الخاصة ب FAMEs في قاعدة البيانات ، وحيث تحدث التطابقات يعين الاسم المقابل للمجهول. بالنسبة للحالات التي يكون فيها اثنان من FAMEs في قاعدة البيانات لهما ECLs قريبة جدا ، يقوم البرنامج بالإبلاغ عن كلا الاسمين الذين يسردون الأقرب أولا. يمكن تجميع جداول البيانات من التقارير في جدول بيانات أو قاعدة بيانات.

بعد تعديل عامل الاستجابة ، يمكن بعد ذلك مقارنة مناطق الذروة بمنطقة الذروة لمعيار خارجي أو داخلي للوصول إلى تركيز المستخلص. من خلال القسمة على كتلة التربة المستخرجة ، يمكن التعبير عن البيانات ككتلة FAME لكل جرام من التربة أو ، باستخدام الوزن الجزيئي لكل FAME ، على شكل نانومول لكل جرام من التربة. يمكن بعد ذلك جمع شهرة المؤشرات الحيوية لإنتاج الكتلة الحيوية للنقابات الميكروبية ، ويمكن تحليل هذه النقابات بشكل أكبر.

على سبيل المثال ، نرى هنا مروج غير مخصبة ذات كتلة حيوية أكثر من البراري المخصبة. كلاهما يحتوي على كتلة حيوية أكثر من حقول الذرة القريبة. أيضا ، ترتبط الشهرة بمجموعات وظيفية معينة مثل الفطريات أو البكتيريا.

هذه الارتباطات خاصة بالنظام البيئي ، لذلك من المهم عدم المبالغة في تعميمها. يوضح هذا النوع من التحليل ما إذا كانت مجموعات معينة أكثر وفرة في بيئات معينة. هنا ، تكون الفطريات أكثر وفرة في البراري غير المخصبة منها في حقل الذرة.

وأخيرا ، هناك طريقة أخرى للنظر إلى التكوين العام للمجتمع الميكروبي وهي المقارنة من خلال النظر إلى الوفرة النسبية لجميع FAMEs في وقت واحد باستخدام طرق الرسامة مثل القياس غير المتري متعدد الأبعاد ، NMDS ، أو تحليل المكونات الرئيسية ، PCA. في الرسامة ، ستكون المجتمعات الميكروبية الأكثر تشابها أقرب من بعضها البعض. لذلك ، من بيانات المثال الخاصة بنا ، فإن الذرة والمروج غير المخصبة متباعدتان جدا ، في حين أن بعض عينات البراري المخصبة لها مجتمعات ميكروبية تشبه تلك الموجودة في الذرة والبعض الآخر يشبه البراري غير المخصبة.

غالبا ما تكون المجتمعات الميكروبية متغيرة للغاية حتى داخل البيئة ، لذلك لن تنفصل دائما بدقة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لدى المرء فهم جيد للعملية التي يتم من خلالها استخراج المؤشرات الحيوية الدهنية من أغشية الخلايا للكائنات الحية الدقيقة من التربة. يعد استخراج الأحماض الدهنية الفوسفوليبيد طريقة فعالة وسريعة وغير مكلفة لتقييم النقابات الميكروبية والكتلة الحيوية الميكروبية الكلية من خلال تحديد المؤشرات الحيوية الميكروبية الفريدة.