وهناك طريقة استخراج مجزأة بسيطة للتحليل الشامل من الأيض، والليبيدات، والبروتينات من عينة واحدة

الهدف العام من هذه الطريقة هو استعادة وتحليل جميع الكيانات الجزيئية الرئيسية، بما في ذلك المستقلبات القطبية وشبه القطبية، والدهون، والبروتينات من عينة واحدة باستخدام استخلاص بسيط ومجزأ بـ methyl-tributyl ether. وبشكل عام، يجد العلماء صعوبة في تحليل فئات متعددة من المركبات من عينة واحدة. وباستخدام استخلاص MTBE الذي نقدمه هنا، يمكنك استخلاص وتحليل فئات متعددة من المركبات، مثل الدهون والمستقلبات والبروتينات من عينة واحدة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في قدرتها على استخلاص جميع فئات المركبات الجزيئية بقوة من كمية صغيرة من جزء عينة واحدة. وتساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية في بيولوجيا الأنظمة، حيث توفر الأساس التجريبي لتحليل الأوميكس المتعدد (multiomics)، من خلال توفير أجزاء يمكن استخدامها في تحليلات البروتينات (proteomics)، والليبيدوميات (lipidomics)، والميتابولوميات (metabolomics). يتم توضيح البروتوكول التالي باستخدام أنسجة أوراق نبات Arabidopsis.

تعد نباتات Arabidopsis نباتات زهرية صغيرة من الفصيلة الكرنبية (Brassicaceae)، وهي مرتبطة بالملفوف. ابدأ هذا الإجراء بتبريد حوامل أنابيب مجانس الأنسجة مسبقاً في النيتروجين السائل لمدة 10 دقائق على الأقل. أخرج العينات من النيتروجين السائل وضعها في حوامل الأنابيب.

ثم أخرج حوامل الأنابيب من النيتروجين السائل. ضع حوامل الأنابيب بسرعة في مجانس الأنسجة، واضبط المجانس لطحن المادة البيولوجية وتحويلها إلى مسحوق ناعم ومتجانس. بالنسبة للأوراق، استخدم تردد 20 hertz لمدة دقيقة واحدة.

قد تختلف مدة وسرعة التجانس اعتماداً على نوع النسيج. تأكد من إجراء التجانس حتى تصبح العينة الناتجة مسحوقاً ناعماً جداً. كما يجب الحفاظ على تجميد العينة في كل خطوة من خطوات التجانس.

قم بتجنيس العينات، ثم أخرج العينات البيولوجية من حوامل الأنابيب. وإذا لم يتم استخدامها على الفور، فضعها في مجمد بدرجة حرارة -80 °C حتى يتم استخلاصها لاحقاً. ضع ملصقات على أربعة أنابيب طرد مركزي دقيقة ذات قاع مستدير وقفل آمن بسعة 2 mL مع كتابة رقم العينة.

قم بتبريد الأنابيب وبعض الملاعق المخبرية مسبقاً عن طريق غمرها في النيتروجين السائل. وبمجرد تبريد الأنابيب والملاعق، ضع أحد الأنابيب على ميزان تحليلي، واستخدم الملعقة المخبرية لوزن 25 milligrams من مسحوق النسيج في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. سجل الوزن الدقيق لكل عينة، ثم ضع العينات الموزونة فوراً في النيتروجين السائل.

قم بتنفيذ هذه الخطوة بسرعة لتجنب إذابة المادة النباتية. احفظ العينات المقسمة عند درجة حرارة -80 °C حتى يتم الاستخلاص لاحقاً. للتحضير للاستخلاص، قم بتبريد مسبق لخليط استخلاص ميثيل ثالثي بوتيل الإيثر (methyl tert-butyl ether)، أو خليط MTBE والميثانول، المُحضر كما هو موضح في المستند المرفق، في مجمد عند درجة حرارة -20 °C.

أخرج العينات المقسمة، وأضف 1 mL من خليط الاستخلاص المبرد مسبقاً إلى كل أنبوب عينة. نفذ هذه الخطوة بسرعة؛ حيث يتميز MTBE بلزوجة منخفضة ويمكن أن يتسرب من طرف الماصة.

امزج كل عينة فوراً باستخدام جهاز الخلط الدوامي (vortex mixer) حتى يتجانس النسيج جيداً داخل خليط الاستخلاص. احتفظ بالأنابيب في حامل على طاولة المختبر حتى يتم استخلاص جميع العينات. هذه الخطوة بالغة الأهمية.

نقوم هنا بترسيب البروتينات وتعطيل أنشطتها الإنزيمية. تُحضن جميع العينات على هزاز مداري بسرعة 100 RPM لمدة 45 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات Celsius. بعد ذلك، تُعرض العينات للموجات فوق الصوتية لمدة 15 دقيقة في حمام سونيكة مبرد بالثلج.

بعد ذلك، ولأجل إجراء التجزئة عن طريق الفصل الطوري، أضف 650 µL من محلول مكون من الماء والميثانول بنسبة ثلاثة إلى واحد إلى كل أنبوب عينة. ثم اخلط المكونات باستخدام جهاز الـ vortex لمدة دقيقة واحدة. قم بطرد العينات مركزياً بسرعة 20,000 ×g لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C.

بعد هذه الخطوة، تعامل مع الأنابيب بحذر لتجنب اختلاط الطورين السائلين وتجنب زعزعة الراسب المترسب. وفي هذه المرحلة، يوجد طوران سائلان مسموح بهما مع وجود راسب صلب في قاع الأنبوب. ويحتوي الطور العلوي غير القطبي على الدهون.

تحتوي الطور المائي السفلي على نواتج أيض قطبية وشبه قطبية. بينما تحتوي الراسبة على البروتينات والنشويات وجدار الخلية. انقل 500 microliters من المذيب من الطور العلوي المحتوي على الدهون إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter مُصنف.

بعد ذلك، وباستخدام ماصة سعة 200 µL، قم بإزالة الطور الدهني المتبقي بعناية وتخلص منه. ثم انقل 400 µL من المذيب من الطور السفلي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL يحمل ملصق تعريف. وانقل كمية إضافية قدرها 200 µL إلى أنبوب طرد مركزي دقيق لإجراء مزيد من التحاليل، مثل تحليل المستقلبات القائم على كروماتوغرافيا الغاز.

قم بإزالة والتخلص من المتبقي من الطور المائي عن طريق سحب الحجم الزائد باستخدام الماصة. بعد ذلك، لغسل الراسب المكون من البروتين والنشا وجدار الخلية، أضف 500 µL من الميثانول ثم قم برج العينات بجهاز الفورتكس لمدة دقيقة واحدة. قم بطرد العينات مركزياً بسرعة 10,000 ×g لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C.

يتم تبخير المذيب من عينات الدهون باستخدام مبخر بتدفق النيتروجين لتجنب التعديلات التأكسدية للدهون. وينبغي تحليل العينات المجففة الناتجة على الفور. أما بالنسبة للعينات المائية، فيتم تبخير المذيب منها طوال الليل في مركز تفريغ دون تسخين.

يمكن تخزين العينات المائية المجففة لعدة أسابيع في درجة حرارة 80- درجة مئوية قبل التحليل. أعد تعليق كسور الدهون المجففة في 400 µL من محلول يتكون من الأسيتونيتريل إلى 2-بروبانول بنسبة سبعة إلى ثلاثة. انقل كمية كافية من السائل إلى قوارير زجاجية وأغلقها بإحكام.

بعد ذلك، ضع القوارير الزجاجية في جهاز أخذ عينات تلقائي مبرد عند درجة حرارة 4 °C. يتم حقن 2 µL من كل عينة وفصل الدهون على عمود C8 ذو طور معكوس يتم الحفاظ عليه عند درجة حرارة 60 °C باستخدام نظام UPLC يعمل بمعدل تدفق قدره 400 µL/min. استخدم الأطوار المتحركة الموضحة في الجدول 1 من المستند المرفق لإجراء الفصل الكروماتوغرافي.

احصل على أطياف الكتلة في نمطي التأين الموجب والسالب باستخدام جهاز MS مناسب يغطي نطاق كتلة يتراوح بين 150 و1500 لنسبة الشحنة إلى الكتلة. أعد تعليق الطور القطبي في 200 µL من محلول مكون من الميثانول بدرجة UPLC والماء بنسبة واحد إلى واحد. انقل كمية كافية من السائل إلى قوارير زجاجية وأغلقها بإحكام.

بعد ذلك، ضع القوارير الزجاجية في جهاز أخذ عينات تلقائي مبرد عند درجة حرارة 4 °C. احقن 2 µL من كل عينة وقم بفصل المستقلبات على عمود RP C-18 محفوظ عند درجة حرارة 40 °C باستخدام نظام UPLC يعمل بمعدل تدفق قدره 400 µL/min. استخدم الأطوار المتحركة للفصل الكروماتوغرافي وفقاً للمعايير الموضحة في الجدول 2 من المستند المرفق.

قم بالحصول على أطياف كتلة بمسح كامل في وضعي التأين الموجب والسالب باستخدام مطياف كتلة مناسب يغطي نطاق كتلة يتراوح بين 50 و1500 لنسبة الكتلة إلى الشحنة. وأخيرًا، قم بإجراء استخلاص البروتين وهضمه وتحليله، كما هو موضح في المستند المرفق. تم حصاد 25 milligrams من أنسجة أوراق Arabidopsis وطحنها واستخلاصها قبل إخضاعها لثلاث منصات تحليلية من نوع UPLC-MS.

تم تحليل المستقلبات الأولية والثانوية القطبية وشبه القطبية من الطور القطبي باستخدام تقنية UPLC-MS ذات الطور المعكوس C-18. وتم تحليل كروماتوغرامات ذروة الأساس للدهون، الموضحة في اللوحة العلوية، والمستقلبات شبه القطبية، الموضحة في اللوحة السفلية، في وضع التأين الموجب. ويوضح المخطط الدائري في الزاوية اليمنى العليا من كل كروماتوغرام عدد الدهون والمستقلبات المحددة والمصنفة ضمن فئات كيميائية مختلفة.

على سبيل المثال، تم تصنيف 58 نوعاً مختلفاً من الدهون ضمن مجموعة ثلاثي أسيل الجليسرول، والتي يرمز لها في المخطط العلوي بـ TAG. أما المستقلبات الأكثر ألفة للماء في هذا الجزء، مثل السكريات والأحماض الأمينية القطبية، والتي لا تظهر احتفاظاً جيداً على مادة الطور المعكوس، فيمكن تحليلها بطرق تحليلية أخرى، مثل GCMS أو كروماتوغرافيا السائل بالتفاعل المحب للماء. أما البروتينات التي استُخلصت فقد خضعت للهضم في المحلول، وحُللت باستخدام تقنية shotgun LCMS.

يوضح المخطط الدائري الموجود في الزاوية العلوية اليمنى عدد البروتينات المحددة المنسوبة إلى عمليات بيولوجية مختلفة. على سبيل المثال، تم تخصيص 268 بروتيناً لفئة التموضع (localization). وباختصار، يمكن تحديد أكثر من 200 نوع من الدهون، و50 من المستقلبات شبه القطبية المشروحة، وعدة آلاف من البروتينات بشكل روتيني من عينات مثل تلك المستخدمة في هذا المثال.

بالإضافة إلى ذلك، أظهرت الطريقة قابلية تطبيق واسعة باستخدام أنسجة وأعضاء ومواد زراعة خلوية مختلفة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخلاص وتحليل معظم المركبات الأساسية من عينة واحدة. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم الحفاظ على جميع العينات مجمدة، وطحن المادة بشكل صحيح، واستخدام مذيبات ومواد كيميائية من الدرجة التحليلية.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن استخدام جميع الطرق التحليلية لتحديد التركيب الجزيئي للعينات المستخلصة.