وهناك طريقة استخراج مجزأة بسيطة للتحليل الشامل من الأيض، والليبيدات، والبروتينات من عينة واحدة

الهدف العام من هذه الطريقة هو استعادة وتحليل جميع الكيانات الجزيئية الرئيسية ، بما في ذلك المستقلبات القطبية وشبه القطبية والدهون والبروتينات من عينة واحدة باستخدام استخراج بسيط مجزأ من ميثيل ثلاثي بوتيل الأثير. بشكل عام ، يجد العلماء صعوبة في تحليل فئات مركبة متعددة من عينة واحدة. باستخدام استخراج MTBE الذي نقدمه هنا ، يمكنك استخراج وتحليل فئات مركبة متعددة ، مثل الدهون والمستقلبات والبروتينات من عينة واحدة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن أن تستخرج بقوة جميع فئات المركبات الجزيئية من كمية صغيرة من عينة واحدة. تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الأساسية في بيولوجيا الأنظمة ، لأنها توفر الأساس التجريبي لتحليل البصمات المتعددة ، وتوفر الكسور التي يمكن استخدامها للتحليل بواسطة البروتينات والدهون والتمثيل الغذائي. يتم توضيح البروتوكول التالي باستخدام أنسجة أوراق نبات الأرابيدوبسيس.

نبات الأرابيدوبسيس هي نباتات مزهرة صغيرة في عائلة Brassicaceae ، وترتبط بالملفوف. ابدأ هذا الإجراء عن طريق التبريد المسبق لحاملات أنبوب خالط الأنسجة في النيتروجين السائل لمدة 10 دقائق على الأقل. قم بإزالة العينات من النيتروجين السائل وضعها في حاملات الأنبوب.

ثم قم بإزالة حاملات الأنابيب من النيتروجين السائل. ضع حاملات الأنابيب بسرعة في خالط الأنسجة ، واضبط الخالط على طحن المادة البيولوجية إلى مسحوق ناعم ومتجانس. بالنسبة للأوراق ، استخدم 20 هرتز لمدة دقيقة واحدة.

قد يختلف وقت التجانس وسرعته حسب الأنسجة. تأكد من تجانس العينة الناتجة حتى تصبح مسحوقا ناعما جدا. ويجب أن تبقى العينة مجمدة في كل خطوة من خطوات التجانس.

قم بتجانس العينات ، ثم قم بإزالة العينات البيولوجية من حاملات الأنابيب. وإذا لم يتم استخدامها على الفور ، ضعها في فريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى مزيد من الاستخراج. قم بتسمية أربعة أنابيب طرد مركزي دقيقة ذات قاع دائري سعة ملليلتر برقم العينة.

قم بتبريد الأنابيب وبعض الملاعق مسبقا عن طريق غمرها في النيتروجين السائل. بمجرد أن تبرد الأنابيب والملاعق ، ضع أحد الأنابيب على ميزان تحليلي ، واستخدم ملعقة لنقل 25 ملليغرام من مسحوق الأنسجة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. سجل الوزن الدقيق لكل عينة ، ثم ضع العينات الناهزة على الفور في النيتروجين السائل.

قم بتنفيذ هذه الخطوة بسرعة لتجنب إذابة الجليد من المواد النباتية. قم بتخزين العينات المقتبسة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى مزيد من الاستخراج. للتحضير للاستخراج ، قم بتبريد خليط استخراج الميثانول الميثيل ثلاثي البوتيل مسبقا ، أو خليط استخراج الميثانول MTBE ، المحضر كما هو موضح في المستند المصاحب ، في فريزر 20 درجة مئوية تحت الصفر.

أخرج العينات المقتبسة ، وأضف ملليلتر واحد من خليط الاستخراج المبرد مسبقا إلى كل أنبوب عينة. قم بتنفيذ هذه الخطوة بسرعة. تتميز MTBE بلزوجة منخفضة ويمكن أن تقطر من طرف الماصة.

امزج كل عينة على الفور على خلاط دوامة حتى يتجانس النسيج جيدا داخل خليط الاستخراج. احتفظ بالأنابيب في رف على المقعد حتى يتم استخراج جميع العينات. هذه الخطوة حاسمة.

هنا نقوم بترسيب البروتينات وتعطيل أنشطتها الأنزيمية. احتضان جميع العينات على شاكر مداري بسرعة 100 دورة في الدقيقة لمدة 45 دقيقة عند أربع درجات مئوية. ثم صوتنة العينات لمدة 15 دقيقة في حمام صوتنة مثلج.

بعد ذلك ، للتجزئة حسب فصل الطور ، أضف 650 ميكرولترا من محلول ثلاثة إلى واحد من الماء والميثانول إلى كل أنبوب عينة. ثم تخلط عن طريق الدوامة لمدة دقيقة واحدة. الطرد المركزي للعينات بسرعة 20 ، 000 مرة جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

بعد هذه الخطوة ، تعامل مع الأنابيب بعناية لتجنب خلط المرحلتين السائلتين وتجنب تعطيل الحبيبات المترسبة. في هذه المرحلة ، هناك مرحلتان سائلتان مقبولتان مع حبيبات صلبة في قاع الأنبوب. تحتوي المرحلة العليا غير القطبية على الدهون.

تحتوي المرحلة المائية السفلية على مستقلبات قطبية وشبه قطبية. تحتوي الحبيبات على البروتينات والنشويات وجدار الخلية. انقل 500 ميكرولتر من المذيب من المرحلة العلوية المحتوية على الدهون إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر.

بعد ذلك ، باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر ، قم بإزالة مرحلة الدهون المتبقية بعناية وتخلص منها. بعد ذلك ، انقل 400 ميكرولتر من المذيب من المرحلة السفلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. انقل كمية إضافية من 200 ميكرولتر إلى أنبوب دقيق لإجراء مزيد من التحليل ، مثل تحليل مستقلب المستند إلى كروماتوغرافيا الغاز.

قم بإزالة والتخلص من ما تبقى من المرحلة المائية عن طريق سحب الحجم الزائد. ثم, لغسل حبيبات جدار خلية البروتين والنشا التي تم الحصول عليها, أضف 500 ميكرولتر من الميثانول ثم قم بدوامها لمدة دقيقة واحدة. الطرد المركزي للعينات بسرعة 10 ، 000 مرة جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

تبخر المذيب من عينات الدهون باستخدام مبخر تدفق النيتروجين لتجنب التعديلات التأكسدية للدهون. يجب تحليل العينات المجففة الناتجة على الفور. تبخر المذيب من العينات المائية طوال الليل في مكثف فراغ بدون تسخين.

يمكن تخزين العينات المائية المجففة لعدة أسابيع عند 80 درجة مئوية تحت الصفر قبل التحليل. أعد تعليق الكسور الدهنية المجففة في 400 ميكرولتر من محلول من سبعة إلى ثلاثة أسيتونيتريل إلى 2-بروبانول. انقل كمية كافية من السائل إلى قوارير زجاجية وقم بتغطيتها بإحكام.

ثم ضع القوارير الزجاجية في جهاز أخذ العينات التلقائي المبرد عند أربع درجات مئوية. قم بحقن ميكرولترين لكل عينة وافصل الدهون على عمود C8 معكوس عند 60 درجة مئوية باستخدام نظام UPLC يعمل بمعدل تدفق 400 ميكرولتر في الدقيقة. استخدم المراحل المتنقلة الموضحة في الجدول 1 من الوثيقة المصاحبة للفصل الكروماتوغرافي.

احصل على أطياف الكتلة في وضع التأين الموجب والسالب باستخدام أداة MS مناسبة تغطي نطاق الكتلة بين 150 و 1500 نسبة شحنة إلى كتلة. أعد تعليق المرحلة القطبية في 200 ميكرولتر من محلول الميثانول من الدرجة UPLC واحد إلى واحد إلى الماء. انقل كمية كافية من السائل إلى قوارير زجاجية وقم بتغطيتها بإحكام.

ثم ضع القوارير الزجاجية في جهاز أخذ العينات التلقائي المبرد بأربع درجات مئوية. قم بحقن ميكرولترين من كل عينة وافصل المستقلبات على عمود RP C-18 مثبت عند 40 درجة مئوية باستخدام نظام UPLC يعمل بمعدل تدفق 400 ميكرولتر في الدقيقة. استخدم المراحل المتنقلة للفصل الكروماتوغرافي مع المعلمات الواردة في الجدول 2 من الوثيقة المصاحبة.

احصل على أطياف كتلة المسح الكامل في وضع التأين الموجب والسالب باستخدام مطياف كتلة مناسب يغطي نطاق كتلة يتراوح بين 50 و 1500 نسبة كتلة إلى شحنة. أخيرا ، قم بإجراء استخراج البروتين وهضمه وتحليله ، كما هو موضح في المستند المصاحب. تم حصاد 25 ملليغرام من أنسجة أوراق نبات الأرابيدوبسيس وطحنها واستخراجها قبل إخضاعها لثلاث منصات تحليلية UPLC-MS.

تم تحليل المستقلبات الأولية والثانوية القطبية وشبه القطبية من المرحلة القطبية بواسطة المرحلة العكسية C-18 UPLC-MS. تم تحليل الكروماتوغرامات الأساسية للدهون ، الموضحة في اللوحة العلوية ، والمستقلبات شبه القطبية ، الموضحة في اللوحة السفلية في وضع التأين الإيجابي. يوضح المخطط الدائري في الزاوية اليمنى العليا من كل مخطط كروماتوغرام عدد الدهون والمستقلبات المحددة المخصصة لفئات كيميائية مختلفة.

على سبيل المثال ، تم تعيين 58 دهونا مختلفة لمجموعة ثلاثي الجليسيرات ، المشار إليها في الرسم البياني العلوي باسم TAG. يمكن تحليل المزيد من المستقلبات المحبة للماء من هذا الجزء ، مثل السكريات والأحماض الأمينية القطبية ، والتي لا تظهر احتفاظا جيدا بمادة الطور العكسي ، بطرق تحليلية أخرى ، مثل GCMS ، أو الكروماتوغرافيا السائلة للتفاعل المحبة للماء. كانت البروتينات التي تم استردادها من الاستخراج في محلول وهضمها وتحليلها باستخدام بندقية LCMS.

يشير المخطط الدائري الموضح في الزاوية اليمنى العليا إلى عدد البروتينات المحددة المخصصة لعمليات بيولوجية مختلفة. على سبيل المثال ، تم تعيين 268 بروتينا لفئة التوطين. باختصار ، يمكن تحديد أكثر من 200 نوع من الدهون ، و 50 مستقلبا شبه قطبي مشروحا ، وعدة آلاف من البروتينات بشكل روتيني من عينات مثل تلك المستخدمة في هذا المثال.

بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت الطريقة قابلية تطبيق واسعة باستخدام أنسجة وأعضاء ومواد زراعة خلوية مختلفة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخراج وتحليل معظم المركبات الأساسية من عينة واحدة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم الحفاظ على جميع العينات مجمدة وطحن المواد بشكل صحيح واستخدام المذيبات والمواد الكيميائية التحليلية.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام جميع الطرق التحليلية لتحديد التركيب الجزيئي للعينات المستخرجة.