تحضير العينات الآلي للتحليل متعدد الخلية لتعديلات ما بعد الترجمة على الهيستون أحادي الخلية (sc-hPTM2)
ديسمبر 19, 2025
هنا، نقدم بروتوكولا لأتمتة تحليل التعديل بعد الترجمة للهيستون أحادي الخلية باستخدام استراتيجية وسم ثنائي النظائر وهضم ArgC. يتيح هذا السير من التحليل الكمي والقابل للتكرار وعالي الحساسية لتغاير الكروماتين والاستجابات فوق الجينية بدقة خلية واحدة.
نحن نطور بروتيوميكس الخلية الواحدة باستخدام طريقة متعددة الخلايا آلية لدراسة التغاير العالمي للكروماتين لإجراء تعديلات ما بعد الترجمة. ما يجعل هذا البروتوكول تحديا هو تحضير البروتين على مقياس البيكوغرام، ووضع العلامات المتعددة، بالإضافة إلى حل الببتيدات الهيستونية المعدلة التركيبية المعقدة. للبدء، أعد بناء خلايا سرطان الخلايا الكبدية لفيروس التهاب الكبد G2/C3A بتركيز نهائي يتراوح بين 200 إلى 500 خلية لكل ميكرولتر في PBS البارد جدا.
اضبط عرض نبضة كل فوهة وجهد المحرك على القيم التي يوفرها المصنع. لتحقيق أقصى كفاءة في الالتقاط، تأكد من أن انحراف Z بين الفوهتين يختلف بأقل من 50 ميكرومتر. حدد الموضع الأمثل للاتصال لكل فوهة وقارن قراءات ارتفاع Z في تبويب إعداد الفوهة.
في نظام التوصيل المتعدد في التوبلكس، قم بتحميل شريحة واحدة على حامل الشريحة في غطاء المحرك ثم انقلها إلى الآلة. باستخدام ماصة، أدخل 150 ميكرولتر من DMSO بدرجة LCMS في أنبوب PCR جديد. ضعه في الموضع الثاني من محطة الغسيل مع غطاء الأنبوب المواجه لباب العدادات.
ابدأ جولة DMSO. احصل على إسقاط مستقر مرة واحدة بعد استنشاق DMSO. لاحظ التغيير في شفافية PDC.
قد يكون من الضروري زيادة الجهد. تحقق من الاستقرار بإجراء فحص انخفاض في مستوى الصوت. قم بإعداد معالج كاميرا الرأس لمحاذاة الكاميرا.
قم بتوزيع DMSO ودع الجهاز يغسل الفوهات تلقائيا والتقاط الصور عبر جميع الشرائح للتحكم في الجودة. راجع هذه الصور للتحقق من وجود قطرة DMSO موحدة على كل شريحة وللتحقق من وجود قطرات مفقودة أو غير مستهدفة. بعد شفط تعليق الخلية، افتح الخلية في وحدة واحدة، وقم بالتقاط الخلفية ثم شغل روتين التعيين لتحديد منطقة القذف.
قم بإجراء التحليل ثم تقوم ببوابة الجسيمات لاختيار الخلايا بناء على الحجم والاستمداد. الآن، حضر خليط هضم جديد في ماء بدرجة LCMS. قم بإزالة الغاز من المحلول بمضخة تفريغ لمدة 10 دقائق على الثلج.
بعد توزيع خليط الهضم على الشرائح، دع الجهاز يقوم تلقائيا بغسل الفوهات والتقاط صور لكل شريحة. راجع الصور للتأكد من أن كل قطرة تتلقى خليط الهضم بشكل متساو. حضن الشرائح في درجة حرارة الغرفة طوال الليل لإجراء عملية الهضم.
بعد بدء عملية التبخر والهضم طوال الليل، افحص الصور. إذا كانت القطرات جافة بما فيه الكفاية، أوقف الجري. إذا لم يكن كذلك، اضغط على الاستمرار وجف لمدة خمس دقائق أخرى.
للوسم، أولا، حضر حلول مخزون لاشتقاق الهيستون متعدد الإرسال. بعد التوزيع، دع الجهاز يغسل الفوهات تلقائيا والتقاط صورة لكل شريحة. راجع الصور لتأكيد التوزيع المتساوي ووضع القطرات الصحيح عبر جميع الشرائح.
بعد انتهاء الحضانة، يتم صرف محلول الهيدروكسي أمين للتبريد. لالتقاط العينة، اختر الجولة في التبويب الرئيسي، ثم ابدأ الجولة في تبويب التشغيل. بعد الانتهاء من عملية الالتقط، راجع الصور للتحقق من أي أخطاء.
بعد الانتهاء من الالتقاط، أزل الغطاء من لوحة الالتقاط. ثم جفف العينات على حرارة منخفضة في جهاز تركيز فراغي. لجمع البيانات، برمج طريقة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء.
اضبط تجربة MS 2 لتحتوي على نوافذ عزل بشحن زائد 50، وتفكك تصادم عالي الطاقة بنسبة 27٪، وهدف التحكم التلقائي في الكسب بنسبة 1000٪. غط اللوح بسجادة مطاطية ووضعها داخل جهاز الأخذ التلقائي. بعد الحصول على الملفات الخام، تحقق بسرعة من الكروماتوجرام ثم قم بتشغيل البيانات الخام في EpiProfile الإصدار 2.1. راجع جدول المخرجات لوفرات PTM الهيستونية المطبعة واستخدمه للتحليلات اللاحقة.
تم قياس أول 20 بيبتيدوفورم هيستوني H3، مما أظهر وفرة نسبية في ظروف السيطرة وبيوتيرات الصوديوم المعالجة. أظهرت كل من أسيتلة H3 K9 وأسيتلة H3 K 14 وفرة نسبية أعلى عند معالجة بيوتيرات الصوديوم. بينما ظهرت أسيتلة K9 في H3، بدا أن أسيتلة K14 أكثر إثراء في الخلايا المعالجة.
ارتفعت مستويات الأسيتلة الكلية بعد معالجة بيوتيرات الصوديوم مع الخلايا المعالجة التي أظهرت توزيع أخطاء أوسع مقارنة بالضوابط مما يعكس التباين الأعلى الذي تم تسجيله على مستوى الخلية الواحدة. أظهر قياس تعديلات الهيستون الفردية والمتزامنة أن حالات الأسيتلة التوافقية كانت الأكثر تأثرا ببيوتيرات الصوديوم. أشار التشتت الأوسع لخلايا بيوتيرات الصوديوم المعالجة إلى زيادة التغاير البيولوجي بين الخلايا الفردية داخل الكرويدات.
يسد هذا البروتوكول الفجوة في البحث فوق الجيني من خلال السماح للعلماء بدراسة حالات الكروماتين عند محلول خلية واحدة. يتيح هذا السير من إعداد عينات عالية الإنتاجية، وتعدد العينات، وتحليل الكتلة غير المتحيز، لإنتاج بيانات فوق جينية حساسة وكمية لخلية واحدة. ستستكشف الأبحاث المستقبلية كيف يغير تنظيم الكروماتين حالات الأمراض مثل السرطان، وأمراض الأيض، والشيخوخة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولًا لأتمتة تحليل تعديلات هيستون بعد الترجمة على مستوى الخلية المفردة باستخدام استراتيجية تسمية ثنائية النظائر. يتيح سير العمل دراسة كمية وحساسة عالية لملف تباين الكروماتين على مستوى الخلية المفردة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بروتيوميات الخلية المفردة
- تعديلات هيستون بعد الترجمة
- تحليل الكروماتين
الخلفية
- التحليل على مستوى الخلية المفردة ضروري لفهم التباين الخلوي.
- تلعب التعديلات بعد الترجمة دورًا رئيسيًا في تنظيم بنية ووظيفة الكروماتين.
- يمكن أن تعزز الطرق الآلية التكرارية والحساسية في دراسات البروتيوميات.
- تشمل التحديات التعامل مع أحجام العينات الصغيرة ومخاليط الببتيدات المعقدة.
هدف الدراسة
- تطوير بروتوكول قوي لتحليل تعديلات هيستون على مستوى الخلية المفردة.
- تحسين كفاءة التسمية المتعددة في سير عمل البروتيوميات.
- معالجة تحديات الببتيدات الهيستونية ذات الوفرة المنخفضة.
الطرق المستخدمة
- إعادة تكوين خلايا Hep G2/C3A في PBS بتركيز محدد.
- تعديل معلمات الفوهة للحصول على أفضل جمع للعينة.
- تنفيذ تسمية ثنائية النظائر للتقييم الكمي.
- استخدام هضم ArgC لتحضير الببتيدات.
النتائج الرئيسية
- أتمتة ناجحة لتحليل تعديلات هيستون على مستوى الخلية المفردة.
- إظهار حساسية عالية وتكرارية في التنميط.
- دقة فعالة في حل الببتيدات الهيستونية المعدلة بشكل مركب معقد.
- رؤى حول تباين الكروماتين والاستجابات اللاجينية.
الاستنتاجات
- يعزز البروتوكول المطور دراسة ديناميكيات الكروماتين على مستوى الخلية المفردة.
- تحسن الأتمتة بشكل كبير من كفاءة تحليل تعديلات هيستون.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة على أسئلة بيولوجية مختلفة تتعلق باللاجينة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Automated single-cell histone PTM analysis addresses the critical challenge of resolving chromatin heterogeneity and epigenetic regulation at cellular resolution. This workflow enhances predictive confidence in early discovery by enabling quantitative, multiplexed profiling of histone modifications across individual cells. The approach supports risk-adjusted portfolio decisions by providing high-content, reproducible data on epigenetic states relevant to disease and therapeutic modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of chromatin regulatory mechanisms at the single-cell level.
- Supports functional target validation by quantifying histone PTM changes in response to perturbations.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct measurement of epigenetic heterogeneity.
- Improves predictive confidence for target selection and triage in epigenetic drug discovery.
Screening & Assay Development
- Prepares validated single-cell systems for downstream screening of epigenetic modulators.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative histone PTM readouts for assay development.
- Enables multiplexed comparison of treatment conditions using isotopic labeling strategies.
- Supports scalable, high-throughput workflows for compound evaluation in chromatin biology.
Translational & Preclinical Research
- Aligns single-cell epigenetic profiling with disease-relevant models such as tumor spheroids.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by capturing cellular heterogeneity in response to therapeutic agents.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative chromatin state data.
- Supports translational biomarker identification for epigenetic drug development.
Pipeline & Workflow Integration
This automated protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling high-content, quantitative analysis of histone PTMs at single-cell resolution.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving cell-to-cell chromatin variability.
- Screening: Provides assay-ready, multiplexed outputs for robust compound screening and comparison.
- Analytics: Delivers quantitative, normalized histone PTM abundance tables for statistical analysis and condition comparison.
- Translational Research: Connects single-cell epigenetic data to disease models and therapeutic response evaluation.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, automated capability for ongoing epigenetic profiling across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in chromatin-targeted discovery.
- Operational Value: Standardizes and automates sample preparation for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by providing high-content, quantitative data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of epigenetic targets and compounds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell proteomics and mass spectrometry data analysis.
- Needs access to automated nano liquid handling and high-resolution LC-MS instrumentation.
- Demands cross-team standardization for sample preparation and data processing workflows.
- Adaptation may be needed for different cell types or disease models.
- Throughput and sensitivity are limited by instrument capacity and sample handling precision.
