الكميات التعبير البروتين والتعاون التعريب عن طريق تعدد المناعية النسيجية تلطيخ والمتعددة الأطياف التصوير

الهدف العام من هذه الطريقة هو التقدير الكمي الموضوعي للتعبير البروتيني والتمركز المشترك باستخدام التصوير متعدد الأطياف. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الأبحاث الأساسية والتشخيص الباثولوجي، مثل كيفية تغير تعبير البروتينات وتمركزها بعد العلاج، أو أثناء تطور المرض. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تزيل الذاتية التي يتسم بها المشغل والموجودة في طرق التقدير الكمي التقليدية.

لبدء عملية القياس الكمي، افتح برنامج التصوير متعدد الأطياف لإنشاء مكتبة طيفية من شرائح التحكم التي تم تحضيرها مسبقاً والمصبوغة بكروموجينات فردية بالإضافة إلى الشريحة المصبوغة بالهيماتوكسيلين. بعد ذلك، افتح مكعب صور تم الحصول عليه من شريحة تحكم، وحدد من أربع إلى خمس مناطق مصبوغة إيجابياً لتحديد الكروموجين بصرياً. كرر هذه الخطوات مع مكعبات الصور من شرائح التحكم الأخرى حتى يتم إنشاء مكتبة طيفية كاملة تمثل جميع الكروموجينات، ثم احفظ المكتبة الطيفية.

ابدأ مشروعاً جديداً داخل برنامج التصوير متعدد الأطياف من خلال اختيار Multispectral أو im3 لخيار صيغة الصور، وBrightfield لصيغة العينة. قم بتكوين المشروع عبر اختيار تقطيع الأنسجة (segment tissue)، والبحث عن السمات (find features)، والتنميط الظاهري (phenotyping)، والتقييم (score)، والتصدير (export). قم بتغيير دقة الصورة لتسريع وقت التحليل، إذا لزم الأمر.

استورد المكتبة الطيفية التي تم إنشاؤها مسبقاً وحدد جميع المواد الملونة التي سيتم تضمينها في التحليل. افتح مكعبات الصور التي سيتم تضمينها في مجموعة بيانات التدريب عن طريق اختيار خيار Open Image Cube. اختر ما لا يقل عن 18% من إجمالي عدد الصور المراد تحليلها لضمان دقة التدريب.

بعد ذلك، اختر مجموعة الصور المستخدمة في التدريب. يجب أن تمثل الصور جميع حالات المرض لزيادة دقة التقسيم. قم بتضمين عدد كبير من صور الصبغ السلبي في مجموعة التدريب لتجنب الانحياز خلال هذه الخطوة.

قم بموازنة اللون الأبيض للصور في مجموعة التدريب عن طريق تحديد أداة القطارة، واختيار منطقة بيضاء في إحدى الصور. حدد زر "advance" للانتقال إلى تقسيم الأنسجة. بعد ذلك، استخدم لوحة فئات الأنسجة لاختيار أنواع الأنسجة المراد تحليلها؛ ولتحقيق تحديد أكثر دقة لموقع البروتين في الأنسجة، يمكن استخدام فئات الأنسجة.

ابدأ في إنشاء الخوارزمية وتحديد فئات الأنسجة باستخدام أداة القلم والرسم حول مجموعات الخلايا داخل صور التدريب. عند الانتهاء من فئة نسيجية واحدة، كرر الخطوة لفئات الأنسجة الأخرى. تأكد من اختيار مجموعات من الخلايا داخل الصور تكون مميزة لنوع الفئة النسيجية.

حدد المكونات التي سيتم تضمينها في تدريب مقسم الأنسجة. اختر مقياس نمط مناسب لتدريب مقسم الأنسجة. ثم اختر زر مقسم الأنسجة المدرب.

لاحظ ظهور مربع منبثق يعرض دقة نسبة البكسلات ضمن مناطق التدريب المصنفة بشكل صحيح. قم بتجزئة مجموعة صور التدريب بأكملها من خلال النقر على "تجزئة الصور". عند الانتهاء، راجع مجموعة التدريب للعثور على أي أنسجة تم تصنيفها بشكل خاطئ باستخدام خوارزمية التدريب الحالية.

عند التأكد من نتائج خوارزمية تقسيم الأنسجة، اختر زر المتابعة. تأكد من تحديد النوى مسبقاً لاختيار السيتوبلازم و/أو الغشاء. اختر علامة تبويب النوى ثم حدد الإعدادات المناسبة لتقسيم النواة.

ثم اختر ما إذا كان سيتم تضمين فئات أنسجة فردية أو جميع فئات الأنسجة في عملية التجزئة. حدد نهج العتبة القائم على كائن الصبغة المضادة (counterstain object based threshold) لاتباع طريقة مبسطة لتحقيق نتائج جيدة. بعد ذلك، اختر نهج العتبة القائم على الكائن (object based threshold) بناءً على صبغة نووية مضادة موثوقة.

حدد المعاملات الخاصة بشكل السيتوبلازم عن طريق اختيار علامة تبويب السيتوبلازم. بعد ذلك، اختر المسافة الخارجية عن النواة. ثم اختر الحد الأدنى للحجم.

حدد مكون الخيار التالي مع اختيار الخيارات الأولية والثانوية، واختيار الخيارات الثالثية كخيارات ثانوية. انتقل إلى علامة تبويب الغشاء. اختر الخيار الأول للمؤشر الخاص بالغشاء المستخدم.

قم بتعديل المقياس الكامل للكثافة الضوئية أو OD لتحديد الحد الأدنى أو قيمة موجبة لكل علامة على أغشية الخلايا. وبالاستمرار تحت علامة تبويب الغشاء، اختر الحد الأقصى لحجم الخلية. بعد اختيار جميع الخيارات، اختر "تقسيم الكل" (segment all).

قم بتطبيق الإعدادات على الصور وملاحظتها. اختر "advance" للانتقال إلى خطوة تقييم الكيمياء النسيجية المناعية (IHC)، ثم اختر فئة النسيج المراد تقييمه. اختر نوع التقييم المطلوب، وحدد الحيز الخلوي الذي سيتم استخدامه في تحليل التقييم.

بعد ذلك، اختر عرض بيانات المكونات (view component data) وحرك المؤشر فوق صور التدريب لتحديد الحد الأدنى المناسب لعتبة الكثافة الضوئية لصبغ الخلايا الإيجابية للمكونات المستهدفة. قم بتصدير بيانات مجموعة التدريب لاختبار الخوارزمية التي تم إنشاؤها من خلال تقسيم الأنسجة وتقسيم الخلايا وقيم التقييم، واتبع المطالبات لإنشاء مجلد جديد لدليل التصدير. اختر الصور والجداول المراد إنشاؤها وتضمينها في التحليل.

بعد ذلك، قم بإجراء التحليل عن طريق اختيار تصدير الكل (export for all). وعند اكتمال التحليل، استعرض بيانات تقسيم الخلايا ونتائج التقييم للصور ذات الصبغات العالية والمنخفضة لتقييم دقة الإعدادات. وبمجرد الرضا عن الإعدادات، انقر فوق علامة تبويب التحليل الدفعي (batch analysis) لنسخ الخوارزمية إلى المشروع النشط.

ثم اختر دليل تصدير جديد وحدد الصور والجداول المراد تضمينها في التحليل. ومن خيار ملفات الإدخال، اختر جميع الصور التي سيتم تضمينها في تحليل الدفعة. حدد خيار التشغيل لبدء التحليل.

عند الانتهاء، انتقل إلى علامة تبويب مراجعة الدمج (review merge). اختر "تضمين الكل" (include all) ثم اختر "دمج" (merge) لإنشاء أوراق بيانات تحتوي على بيانات ملخصة للتحليل. تم إجراء التدريب على أنسجة البروستاتا لتقسيم الصور إلى أجزاء ظهارية وأجزاء سدوية.

إلى جانب قسم غير نسيجي. تم استيراد مجموعة من صور التدريب في برنامج التصوير متعدد الأطياف لتمثيل أنواع الأنسجة وحالات المرض في المجموعة الكاملة من الصور. وأنشئت فئات نسيجية تشمل السدى، والظهارات، وغير النسيجية، حيث تم تحديد هذه الفئات عن طريق الرسم اليدوي فوق صور التدريب.

تم إنشاء خوارزمية لتقسيم الأنسجة وتطبيقها على مجموعة صور التدريب، وذلك لتقسيم الأنسجة بدقة. وباستخدام تقنية الكيمياء النسيجية المناعية متعددة الألوان، تم تحديد الخلايا الإيجابية للتعبير النووي لـ ER-alpha (التي ظهرت باللون الأحمر) وAR (التي ظهرت باللون البني)، وذلك على الرغم من تداخل الإشارات اللونية والمترية. كما تم قياس التعبير النوعي لـ CD-147 في غشاء الخلية باستخدام E-catherine (الذي ظهر باللون الأسود) كبروتين علامة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقدير كمية التعبير البروتيني والتوضع المشترك في الأنسجة المثبتة والمضمنة في البارافين.