بروتوكولات لتصور الستيرويدي المنشأ أجهزة وهيئات التفاعلية مع المناعية في ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور الأعضاء الستيرويدية وأعضائها التفاعلية في اليرقات أو الإناث البالغات من ذبابة الفاكهة ، ذبابة الفاكهة السوداء. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في فهم التخليق الحيوي لهرمون الستيرويد للحشرات ، والآلية التنظيمية العصبية الكامنة وراء التزاوج والتحول. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن تعصيب الأعضاء الستيرويدية والجزء النسبي من أعضائها التفاعلية يظل سليما.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن الأعضاء الستيرويدية في يرقات الذباب صغيرة جدا وشفافة. يسعدني أنا ومختبري مشاركة بروتوكولات التشريح الخاصة بنا. لذا ، فلنبدأ.

بعد تحضير اليرقات ، ابدأ تشريح الدورة في طبق ثلاثة سنتيمترات مليء ب PBS ، تحت مجهر تشريح. أولا ، أمسك خطاف الفم بالملقط. ثم ، باستخدام مقص صغير ، اقطع الجسم بحوالي ثلث الطول من الطرف الأمامي.

بعد ذلك ، أمسك الطول الأمامي بزوج واحد من الملقط واستخدم زوجا ثانيا لدفع طرف الرأس برفق إلى الجسم ، لتحويل جسم اليرقات في النهاية من الداخل إلى الخارج. قم بإعداد ما يصل إلى 20 يرقة بهذه الطريقة في غضون 10 دقائق ، ثم انقلها إلى محلول تثبيت. بعد 30 دقيقة ، اغسل المستحضرات ، واستمر في تلطيخ المناعة.

للبدء ، اترك اليرقات مغمورة في الماء لمدة ساعة تقريبا ، للاختناق وبالتالي شل حركة اليرقات. بعد ذلك ، ضع الجانب الظهري لليرقة لأعلى في قطرة من PBS على طبق مغطى بالسيليكون. يحتوي الجانب الظهري على أنبوبين قصبيتين.

تحت مجهر تشريح ، استخدم الملقط لإدخال دبوس حشرة في الطرف الأمامي. ثم قم بتمديد الجسم إلى الجانب الخلفي وضع دبوس ثان في الطرف الخلفي. بعد ذلك ، قم بعمل شق صغير بالقرب من الذيل باستخدام مقص صغير.

من الشق ، قم بقص البشرة الظهرية بعناية طوليا على طول خط الوسط الظهري ، باتجاه الرأس ، مع عدم إتلاف أي من الأنسجة الموجودة أسفل البشرة. بعد إجراء الشق ، قم بتمديد جدران الجسم بعيدا ، وقم بتثبيتها بدبابيس الحشرات في الزوايا. بعد ذلك ، باستخدام الملقط ، قم بإزالة الجسم الدهني الأمامي والغدد اللعابية ، وبالتالي تعريض مجمع الغدة الحلقية الدماغية على السطح.

الآن ، استنشق PBS ، واغمر المستحضر في محلول تثبيتي. بعد 30 دقيقة ، استخدم الملقط لإزالة دبابيس الحشرات ونقل المستحضر إلى أنبوب دقيق مملوء بنسبة 0.3٪ PBT. ثم تابع تلبوخية المناعة.

بعد تلطيخ اليرقات المناعية ، استخدم ماصة يمكن التخلص منها لنقل العينات إلى طبق مملوء بنسبة 0.3٪ PBT. تحت مجهر تشريح ، أمسك بشرة أو خطاف الفم بزوج واحد من الملقط. بعد ذلك ، استخدم إبرة قياس 27 متصلة بحقنة سعة مليلتر واحد ، مثل السكين ، لإزالة مركب قرص العين في الغدة الحلقية الدماغية من بشرة الجسم ، عن طريق قطع الطرف الأمامي للمريء وأقراص العين.

بعد ذلك ، باستخدام الملقط ، افصل المريء والأمعاء بعناية عن مركب قرص العين في الغدة الحلقية الدماغية. اسحب القناة الهضمية إلى الجانب الخلفي ، لأن المريء يمر عبر الدماغ فوق الحبل العصبي البطني. أخيرا ، لعزل مجمع الغدة الحلقية الدماغية ، قم بقطع الوصلات بين قرص الدماغ وأقراص العين وأقراص الساق بعناية بسكين إبرة.

من الضروري جدا استخدام ملقط دقيق بحواف حادة أثناء التشريح. أوصي بشدة بشحذ الملقط بقطعة من حجر الطحن لتجميع حوافها معا دون أي فجوات. لنقل العينات، استخدم ماصة صغيرة ذات طرف تجويف عريض.

قم بإيداع العينات في وسط الشريحة الزجاجية. بعد ذلك ، استخدم الملقط لوضع العينات على جانبيها البطنيين ، بحيث يمكن تصوير الغدة الحلقية ، الموجودة على الجانب الظهري من الدماغ. بعد ذلك ، قم بإمالة الشريحة وامسح أكبر قدر ممكن من PBT الزائد.

بعد ذلك ، ضع قطرة من كاشف التثبيت بالقرب من العينات واستخدم الملقط لخفض زلة الغطاء ببطء فوق الكاشف ، ثم فوق العينات. لتشريح المبيض الأنثوي البالغ ، قم بتخدير الذباب بغاز ثاني أكسيد الكربون. ثم اقطع رؤوسهم وانقل أجسادهم إلى طبق طوله ثلاثة سنتيمترات مليء ببرنامج تلفزيوني.

بعد ذلك ، تحت مجهر تشريح ، أمسك الجانب الظهري من الصدر بالملقط ، وأمسك بالجزء البطني A-5 أو A-6 بزوج ثان من الملقط. ثم انزع بشرة البطن باتجاه الجانب الخلفي. قبل المتابعة ، نظف البشرة اللاصقة من الملقط.

بعد ذلك ، اضغط على جسر المبيض وعزل المبيض. ثم قم بتمشيط أطراف المبيض ونشرها باستخدام الملقط. بمجرد الانتشار ، اغمر المبيض في محلول مثبت لمدة 30 دقيقة ، لتحضيره للتلطيخ.

لعمل مستحضر يحافظ على تعصيب المبيض ، انقل إناث الذباب المخدر إلى طبق مغطى بالسيليكون مليء ب PBS. تحت مجهر التسليح ، أمسك خرطوم ، وانزع بشرة الرأس لكشف الدماغ. من الدماغ، قم بإزالة القصبة الهوائية المرفقة، تاركا الدماغ متصلا بالحبل العصبي البطني.

ثم أمسك الصدر من الجانب الظهري ، وقم بإزالة الساقين والأجنحة. بعد ذلك ، قم بإزالة بشرة الصدر البطنية ، بدءا من قاعدة كل ساق. بمجرد تعرض VNC ، قم بإزالة البشرة الظهرية المتبقية والعضلات المتصلة ب VNC بعناية فائقة باستخدام الملقط.

لا تتلف الوصلات بين الدماغ و VNC. بعد ذلك ، باستخدام الملقط ، قم بتقشير بشرة البطن لكشف المبايض وأعضائها التفاعلية ، والتي تشمل الدعامة والأمعاء والقناة المبيضية والرحم والغدة الملحقة. أخيرا ، قم بإزالة أي أنسجة متبقية ، بما في ذلك القصبة الهوائية والجسم الدهني.

ثم اغمر العينات في محلول مثبت لمدة 30 دقيقة لإعدادها للتلوين المناعي. بعد التلوين المناعي ، انقل العينات إلى شريحة زجاجية تحتوي على 0.1٪ PBT باستخدام ماصة دقيقة. بعد ذلك ، اعرض الشريحة بالمجهر ، وافصل خيوط المبيض عن بعضها البعض باستخدام الملقط.

لا تؤذي أطراف المبيض أثناء هذه العملية. أنها تحتوي على الجرمانيا. عند تحضير الدماغ لمركب الأعضاء التناسلية ، قم بإزالة أي بشرة متبقية ، وانشر الهياكل على الشريحة.

بعد ذلك ، امسح معظم PBT الزائد ، ثم قم بتطبيق قطرة من كاشف التركيب على العينة. بعد ذلك ، ضع غطاء ببطء على الشريحة باستخدام ملقط وقم بتخزين الشريحة عند أربع درجات مئوية في الظلام. في وقت لاحق ، راقب العينات تحت المجهر ، وأحضر الأعضاء الستيرويدوجينيك إلى مجال الرؤية.

بمجرد إصلاح العرض، قم بتبديل نظام التصوير إلى وضع الحصول على الصور. خلال مراحل اليرقات ، تم تصنيف الغدة الأولية بأجسام مضادة ضد الإنزيمات المضادة للستيرويدات ، بما في ذلك الجسم المضاد للكفن. لتصور العلاقة العصبية بين الغدة الأولية والدماغ ، تم تشريح مركب الغدة الحلقية الدماغية.

تظهر طريقة تشريح فيليه الجهاز العصبي للفم المعدي ، حيث تنبثق مجموعة من الخلايا العصبية السيروتونية إلى الغدة الأولية ، والعضلات البروفنتريكولوس ، والبلعوم. في الإناث البالغات ، يؤثر ecdysteroid المبيض على العديد من جوانب تكوين المبيضات ، مثل انتشار GSC. توجد GSCs في الجراثة عند طرف كل مبيض في المبيض.

داخل الجراثة ، تم تصنيف GSCs على وجه التحديد باستخدام جسمين مضادين ، 1B1 و DE-cadherin. لتصور تعصيب المبيض ، تم تشريح المبيض ، جنبا إلى جنب مع الدماغ ، VNC ، الأمعاء ، الدعامة ، الرحم ، المنوية. تم تصور الخلايا العصبية بواسطة mCD8: GFP تحت سيطرة برنامج تشغيل n-Synaptobrevin GAL4.

بالإضافة إلى ذلك ، تم تلطيخ بنية العضلات باستخدام الفالودين ثنائي التقترب. على الرغم من أن تشريح الأعضاء الستيرويدية يمكن أن يشعر في البداية بصعوبة ، استخدم هذا الفيلم لمعرفة نقطة قطع الأنسجة لعزل العضو بسهولة أكبر دون إصابة. نأمل أن يكون بروتوكولنا مفيدا ، ليس فقط للمبتدئين ، ولكن أيضا للباحثين ذوي الخبرة.

بمجرد إتقانها ، يمكنك تطبيق هذا الإجراء على بحثك ، وصقله ليناسب احتياجاتك. نأمل أن يساعد هذا البروتوكول في الفهم الشامل للتخليق الحيوي لهرمون الستيرويد. تتوفر بروتوكولات أكثر تفصيلا خطوة بخطوة في المخطوطة.

يرجى التحقق من ذلك.