بروتوكولات لتصور الستيرويدي المنشأ أجهزة وهيئات التفاعلية مع المناعية في ذبابة الفاكهة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير الأعضاء المولدة للستيرويدات والأعضاء التفاعلية المرتبطة بها في اليرقات أو الإناث البالغة من ذبابة الفاكهة، *Drosophila melanogaster*. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في فهم التخليق الحيوي للهرمونات الستيرويدية في الحشرات، والآلية التنظيمية العصبية التي تكمن وراء التزاوج والتحول. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أن التعصيب للأعضاء المولدة للستيرويدات والجزء النسبي من أعضائها التفاعلية يظل سليمًا.

بشكل عام، سيواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة صعوبة لأن الأعضاء المولدة للستيرويدات في يرقات الذباب صغيرة جداً وشفافة. يسعدني أنا ومختبري مشاركة بروتوكولات التشريح الخاصة بنا. لذا، فلنبدأ.

بعد تحضير اليرقات، ابدأ عملية التشريح في طبق بقطر ثلاثة سنتيمترات مملوء بمحلول PBS، تحت مجهر تشريحي. أولاً، أمسك بخطاف الفم باستخدام ملقط. ثم، وباستخدام مقص دقيق، افصل الجسم عند حوالي ثلث الطول من الطرف الأمامي.

بعد ذلك، أمسك الطرف الأمامي بملقط واحد، واستخدم ملقطًا ثانيًا لدفع طرف الرأس بلطف نحو الجسم، وذلك لقلب جسم اليرقة في النهاية من الداخل إلى الخارج. جهّز ما يصل إلى 20 يرقة بهذه الطريقة خلال 10 دقائق، ثم انقلها إلى محلول التثبيت. وبعد مرور 30 دقيقة، اغسل العينات الجاهزة، ثم ابدأ بعملية التصبيغ المناعي.

للبدء، اترك اليرقات مغمورة في الماء لمدة ساعة تقريبًا، وذلك لخنق اليرقات ومن ثم تثبيتها. بعد ذلك، ضع يرقة واحدة بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى في قطرة من PBS على طبق مطلي بالسيليكون. يحتوي الجانب الظهري على أنبوبين قصبيين.

باستخدام مجهر تشريحي، استخدم الملقط لإدخال دبوس حشرات في الطرف الأمامي. بعد ذلك، قم بشد الجسم باتجاه الجانب الخلفي وضع دبوساً ثانياً في الطرف الخلفي. ثم، قم بعمل شق صغير بالقرب من الذيل باستخدام مقص دقيق.

بدءاً من الشق، قم بقص القشيرة الظهرية بعناية بشكل طولي على طول الخط الناصفي الظهري باتجاه الرأس، مع الحرص على عدم إتلاف أي من الأنسجة الموجودة تحت القشيرة. بعد إجراء الشق، باعد بين جدران الجسم وثبتها باستخدام دبابيس الحشرات عند الزوايا. بعد ذلك، استخدم الملقط لإزالة الجسم الدهني الأمامي والغدد اللعابية، مما يؤدي إلى كشف مجمع غدة الحلقة الدماغية على السطح.

الآن، قم بشفط محلول PBS، واغمر العينة في محلول التثبيت. وبعد مرور 30 دقيقة، استخدم الملقط لإزالة دبابيس الحشرات ونقل العينة إلى أنبوب دقيق مملوء بمحلول 0.3%PBT. بعد ذلك، ابدأ بعملية التصبيغ المناعي.

بعد صبغ اليرقات مناعيًا، استخدم ماصة ذات استخدام واحد لنقل العينات إلى طبق مملوء بـ 0.3%PBT. تحت مجهر تشريحي، أمسك القشيرة أو خطاف الفم باستخدام زوج من الملاقط. بعد ذلك، استخدم إبرة قياس 27 متصلة بمحقنة سعة 1 مل، كالمشرط، لإزالة معقد الغدة الحلقية والدماغ وقرص العين من قشيرة الجسم، وذلك عن طريق قطع الطرف الأمامي للمريء وأقراص العين.

بعد ذلك، وباستخدام الملقط، افصل المريء والأمعاء بعناية عن معقد الدماغ والغدة الحلقية وقرص العين. اسحب الأمعاء باتجاه الجانب الخلفي، نظرًا لأن المريء يمر عبر الدماغ فوق الحبل العصبي البطني. وأخيرًا، لعزل معقد الدماغ والغدة الحلقية، اقطع بعناية الروابط بين قرص الدماغ وأقراص العين وأقراص الأرجل باستخدام سكين إبرية.

من الضروري جداً استخدام ملقط دقيق ذو حواف حادة أثناء عملية التشريح. وأوصي بشدة بشحذ الملقط باستخدام قطعة من حجر الجلخ لضمان تلاقي حواف الملقط تماماً دون وجود أي فجوات. ولنقل العينات، استخدم ماصة دقيقة (micro pipet) ذات طرف واسع الفوهة.

ضع العينات في مركز الشريحة الزجاجية. بعد ذلك، استخدم الملقط لوضع العينات على جوانبها البطنية، بحيث يمكن تصوير الغدة الحلقية الموجودة على الجانب الظهري للدماغ. بعد ذلك، قم بإمالة الشريحة ومسح أكبر قدر ممكن من مادة PBT الزائدة.

بعد ذلك، ضع قطرة من كاشف التثبيت بالقرب من العينات واستخدم الملاقط لخفض شريحة غطاء ببطء فوق الكاشف، ثم فوق العينات. لتشريح مبيض الأنثى البالغة، قم بتخدير الذباب باستخدام غاز ثاني أكسيد الكربون. ثم اقطع رؤوسها وانقل أجسامها إلى طبق بقطر ثلاثة سنتيمتر مملوء بـ PBS.

بعد ذلك، وباستخدام مجهر تشريحي، أمسك الجانب الظهري من الصدر بملقط، ثم أمسك القطعة البطنية A-5 أو A-6 بملقط ثانٍ. بعد ذلك، قم بتقشير cuticle البطن باتجاه الجانب الخلفي. وقبل المتابعة، قم بتنظيف cuticle اللزج عن الملقط.

بعد ذلك، قم بقرص القناة البيضية وعزل المبيض. ثم قم بتمشيط وبسط أطراف المبيض باستخدام الملاقط. وبمجرد بسطها، اغمر المبيض في محلول التثبيت لمدة 30 دقيقة، وذلك لتحضيرها للتلوين.

لإعداد عينة تحافظ على التعصيب في المبيض، انقل الذباب الإناث المخدر إلى طبق مطلي بالسيليكون ومملوء بـ PBS. وباستخدام مجهر التشريح، أمسك بالخرطوم، وقم بإزالة كيوتيكل الرأس للكشف عن الدماغ. ومن الدماغ، قم بإزالة القصبات الهوائية المتصلة، مع إبقاء الدماغ متصلاً بالحبل العصبي البطني.

بعد ذلك، أمسك بالصدر من الجانب الظهري، وقم بإزالة الأرجل والأجنحة. ثم، انزع القشيرة البطنية للصدر، بدءاً من قاعدة كل رجل. وبمجرد ظهور الحبل العصبي البطني (VNC)، قم بإزالة بقايا القشيرة الظهرية والعضلات المتصلة بـ VNC بعناية فائقة باستخدام الملقط.

تجنب إتلاف الوصلات بين الدماغ والعقدة العصبية البطنية (VNC). بعد ذلك، وباستخدام الملقط، قم بإزالة جلد البطن لكشف المبيضين وأعضائهما التفاعلية، والتي تشمل الدعامة، والأمعاء، وقناة البيض، والرحم، والغدة الملحقة. وأخيراً، قم بإزالة أي أنسجة متبقية، بما في ذلك القصبة الهوائية والجسم الدهني.

بعد ذلك، اغمر العينات في محلول التثبيت لمدة 30 دقيقة، لتحضيرها لعملية الصبغ المناعي. وبعد الصبغ المناعي، انقل العينات إلى شريحة زجاجية تحتوي على 0.1%PBT باستخدام ماصة دقيقة. ثم افحص الشريحة باستخدام المجهر، وافصل خيوط المبيضيّات عن بعضها البعض باستخدام الملقط.

تجنب إصابة أطراف المبييضات أثناء هذه العملية، حيث تحتوي هذه الأطراف على المبيضات الأولية. وعند تحضير المعقد المكون من الدماغ والأعضاء التناسلية، قم بإزالة أي بقايا من القشيرة، ثم قم بفرد التراكيب على الشريحة.

بعد ذلك، امسح معظم فائض صبغة PBT، ثم ضع قطرة من كاشف التثبيت على العينة. بعد ذلك، ضع شريحة غطاء ببطء فوق الشريحة باستخدام الملقط، واحفظ الشريحة في درجة حرارة 4 °C في الظلام. لاحقاً، افحص العينات تحت المجهر، واجعل الأعضاء المولدة للستيرويدات في مجال الرؤية.

بمجرد تثبيت الرؤية، قم بتحويل نظام التصوير إلى وضع التقاط الصور. خلال المراحل اليرقية، تم وسم الغدة أمام الصدرية بأجسام مضادة ضد الإنزيمات المولدة للإيكديستيروئيد، بما في ذلك الجسم المضاد anti-shroud. ولتصوير الاتصال العصبي بين الغدة أمام الصدرية والدماغ، تم تشريح معقد الدماغ والغدة الحلقية.

تُظهر طريقة تشريح الفيليه الجهاز العصبي المعدي الفموي، حيث تمتد مجموعة من العصبونات السيروتونينية إلى الغدة أمام الصدرية، والمعدة الأولية، وعضلات البلعوم. وفي الإناث البالغات، يؤثر الإيكديستيرويد المبيضي على العديد من جوانب تكوين البويضات، مثل تكاثر الخلايا الجذعية الجرثومية (GSC). وتقع هذه الخلايا الجذعية الجرثومية في الجيرماريوم عند طرف كل مبيضة في المبيض.

داخل الغيرماريوم (germarium)، تم تمييز الخلايا الجذعية الجرثومية (GSCs) بشكل محدد باستخدام جسمين مضادين، وهما 1B1 و DE-cadherin. ولتصوير التعصيب في المبيض، تم تشريح المبيض جنباً إلى جنب مع الدماغ، والسلسلة العصبية البطنية (VNC)، والأمعاء، والبروب (prop)، والرحم، والقناة المنوية (spermatheca). وتم تصوير العصبونات بواسطة mCD8:GFP تحت تحكم محرك n-Synaptobrevin GAL4.

بالإضافة إلى ذلك، تم صبغ بنية العضلات باستخدام phalloidin المقترن. ورغم أن تشريح الأعضاء المولدة للستيرويدات قد يبدو صعباً في البداية، إلا أنه يمكن الاستعانة بهذا الفيديو لتعلم نقاط قطع الأنسجة لعزل العضو بسهولة أكبر دون التسبب في إصابته. نأمل أن يكون البروتوكول الخاص بنا مفيداً، ليس فقط للمبتدئين، بل وأيضاً للباحثين ذوي الخبرة.

بمجرد إتقان هذا الإجراء، يمكنك تطبيقه في أبحاثك، وتعديله ليتناسب مع احتياجاتك. نأمل أن يساعد هذا البروتوكول في الفهم الشامل للتخليق الحيوي للهرمونات الستيرويدية. تتوفر بروتوكولات أكثر تفصيلاً وخطوة بخطوة في المخطوطة.

يرجى الاطلاع عليه.