LERLIC-MS / MS للمتعمقة توصيف والكمي لالجلوتامين والهليونين نزع الأميد في البندقية البروتيوميات

هنا نقدم بروتوكول خطوة بخطوة من طول فترة طويلة للكهرباء-التنافر ماء التفاعل اللوني، جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (LERLIC-MS / MS) الأسلوب. هذا هو منهجية جديدة تمكن لتقدير مرة الأولى، وتوصيف الجلوتامين والأسباراجين الإسوية نزع الأميد من البروتينات طلقات نارية.

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام بروتينات البندقية لتوصيف وقياس منتجات إزالة الجلوتامين والأسباراجين الذاتية في البروتينات المعقدة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في الكيمياء الحيوية ، مثل تأثير المعالجات التلقائية والمضادة للعوامل على المنتج متساوي القياس gluteo للجلوتامين وإزالة الهليون. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن أيزومرات إزالة أمينشن الجلوتامين يتم فصلها على عمود شعري متغير أيوني طويل الطول ، مما يزيد من القدرة على فصل الببتيدات بواسطة النقاط المتماثلة.

لبدء بناء العمود ، قم بتعليق 50 ملليغرام من مواد تعبئة تبادل الأنيون الضعيفة في 3.5 مل من 90٪ من الأيزوبروبانول في الماء. تأمين تركيب أنثى إلى أنثى ، ميكروفيرال ، وصمولة أنثوية في أحد طرفي طول 50 سم من أنابيب الذروة بقطر داخلي يبلغ 200 ميكرومتر. قم بتركيب شاشة 1/16 بوصة مع مسام ميكرومتر واحد في نهاية الأنبوب داخل microferal.

باستخدام مضخة الضغط التي تم ضبطها على 4 ، 500 رطل لكل بوصة مربعة ، قم بتعبئة تبادل الأنيون في الشعيرات الدموية حتى تصبح المادة مرئية في الأعلى. قم بإرفاق تركيبات أخرى من أنثى إلى أنثى ، وميكروفيرال ، وأنثى بالجزء العلوي من الشعيرات الدموية المعبأة في الطرف المقابل لإنهاء تجميع العمود. اغسل 50 إلى 100 ملليغرام من الأنسجة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات لمدة خمس دقائق.

كرر هذا الغسيل مرتين ، ثم ضع المنديل المغسول في أنابيب بأغطية أمان. أضف إلى كل أنبوب وزنا واحدا يعادل حبات الفولاذ المقاوم للصدأ ، و 2.5 ما يعادل حجم محلول مائي 100 مللي مولار من أسيتات الأمونيوم مع 1٪ ديوكسيكولات الصوديوم. تجانس الأنسجة بأقصى كثافة لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

ثم ، قم بالطرد المركزي المتجانس لمدة عشر دقائق عند 10 ، 000 × جم وأربع درجات مئوية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. استمر في تجانس وطرد بيليه الأنسجة ، والجمع بين المواد الطافية في كل مرة حتى لا يلاحظ أي بيليه.

حدد تركيز البروتين في المواد الطاففية المركبة باستخدام مقايسة حمض البيسنشونيك. بعد ذلك ، أضف إلى التجانس محلول مولاري واحد من dithiothreitol في 100 مللي مولار أسيتات الأمونيوم للوصول إلى تركيز عشرة مللي مولار dithiothreitol في العينة. احتضان الجانس في حمام مائي عند 60 درجة مئوية لمدة ثلاثين دقيقة.

أضف إلى التجانس محلول مولاري واحد من اليودوأسيتاميد في 100 مللي مولار أسيتات الأمونيوم للوصول إلى تركيز 20 ملليمولار من اليودوأسيتاميد في العينة. احتضان الجانس في درجة حرارة الغرفة في حالة عدم وجود ضوء لمدة 45 دقيقة. ثم قم بتخفيف الجانس بمكافئين حجميين لمحلول عشرة مللي مولار من ثنائي ثيوثريتول في 100 مللي مولار أسيتات الأمونيوم.

احتضان الجانس عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. أضف إلى التجانس حجما كافيا من التربسين المعدل بدرجة التسلسل في 100 مللي مولار أسيتات الأمونيوم لتحقيق نسبة إنزيم بروتين من 1 إلى 50 بالوزن في العينة. احتضان العينة عند 30 درجة مئوية طوال الليل لهضم المتجانس.

قم بإخماد عملية الهضم بنسبة 0.5٪ من وزن عينة حمض الفورميك ، مما يؤدي إلى ترسيب أملاح ديوكسي كولات الصوديوم. قم بتدوير العينات التي تحتوي على أملاح SDC برفق ثم قم بالطرد المركزي للعينات لمدة عشر دقائق عند 12،000 × جم وأربع درجات مئوية. صب المادة الطافية في أنبوب جديد ، مع الحرص على عدم إزعاج حبيبات أملاح SDC.

أعد إذابة الأملاح في محلول مائي 0.5٪ من حيث الحجم من هيدروكسيد الأمونيوم ، مع دوامة قوية. قم بتكييف خرطوشة ماصة C-18 بوزن جرام واحد ب 5 ملليلتر من الأسيتونيتريل ، متبوعة بخمسة ملليلتر من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك 0.1٪ في الماء. ثم قم بتحميل العينة المهضومة على الخرطوشة.

اغسل العينات ثلاث إلى خمس مرات بخمسة مليلتر من 0.1٪ TFA. ثم قم بتخفيف الببتيدات بخمسة ملليلتر من محلول مائي 75٪ أسيتونيتريل و 0.1٪ حمض الفورميك. جفف السائل في مكثف فراغ.

أضف 200 ميكرولتر من الأسيتونيتريل 75٪ ، مع 0.1٪ حمض الفورميك إلى البقايا. دوامة الخليط لمدة عشر دقائق على الأقل ، ثم صوتنة الخليط لمدة 30 دقيقة على الأقل لإعادة تكوين الببتيدات الجافة. خفف العينة حسب الحاجة ، بحيث تحتوي العينة المحقونة على ميكروغرام إلى ثلاثة ميكروغرام من البروتين.

قم بتوصيل العمود الشعري LAX بأداة كروماتوغرافيا سائلة ذات ضغط عال للغاية. تحضير محاليل حمض الفورميك 0.1٪ في الماء والأسيتونيتريل. اضبط معدل التدفق على 0.4 ميكرولتر في الدقيقة ، وقم بإعداد تشغيل متدرج لمدة 1 ، 200 دقيقة.

قم بتكوين أحداث مسح مطياف الكتلة لإجراء الحصول على البيانات بالتناوب ، بين قياس الطيف الكتلي لتحويل فورييه الكامل وقياس الطيف الكتلي الترادفي لتحويل فورييه. قم بإجراء LERLIC MS / MS لفصل وتوصيف الببتيدات. استخدم البيانات الناتجة والبرامج البروتينية لإجراء بحث في قاعدة بيانات البروتين.

تصدير نتائج البحث في قاعدة البيانات إلى برنامج جداول البيانات. تحديد واستخراج قائمة الببتيدات منزوعة الدقة والببتيدات غير المضادة للببتيدات المقابلة. استخرج الكروماتغرامات الأيونية لكل من هذه الببتيدات بخمسة أجزاء في المليون من تحمل الكتلة.

افحص الكروماتغرامات الأيونية المستخرجة بحثا عن وهم الذروة المزدوجة المنفصلة للمنتجات الأيزومرية. باستخدام LERLIC MS / MS ، تم فصل الأشكال الإسوية منزوعة الأمين للجلوتامين والأسباراجين وتحديدها من عينة بروتين في وقتين مختلفين للاحتفاظ. تم تحديد بقايا الجلوتامين الوسيطة المعدلة إنزيميا من الترانس أظهرت نسبة جاما ألفا جلوتاميل مقلوبة.

كما تم تحديد وسيط السكسينيميد في بقايا الهليون بهذه الطريقة. نظرا لأن ظروف معالجة العينة الحمضية المعتدلة تعمل على استقرار وسيط السكسينيميد. يشير هذا إلى أنه يمكن تطبيق تقنية LERLIC MS / MS على دراسة البروتيوم الواسعة للمواد الوسيطة السكسينيميد.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في الكيمياء الحيوية لتوصيف إزالة البروتين في سياقات تتراوح من علم الآثار إلى البحوث الطبية الحيوية.