LERLIC-MS / MS للمتعمقة توصيف والكمي لالجلوتامين والهليونين نزع الأميد في البندقية البروتيوميات
April 9th, 2017
هنا نقدم بروتوكول خطوة بخطوة من طول فترة طويلة للكهرباء-التنافر ماء التفاعل اللوني، جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (LERLIC-MS / MS) الأسلوب. هذا هو منهجية جديدة تمكن لتقدير مرة الأولى، وتوصيف الجلوتامين والأسباراجين الإسوية نزع الأميد من البروتينات طلقات نارية.
الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام بروتينات البندقية لتوصيف وقياس منتجات إزالة الجلوتامين والأسباراجين الذاتية في البروتينات المعقدة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في الكيمياء الحيوية ، مثل تأثير المعالجات التلقائية والمضادة للعوامل على المنتج متساوي القياس gluteo للجلوتامين وإزالة الهليون. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن أيزومرات إزالة أمينشن الجلوتامين يتم فصلها على عمود شعري متغير أيوني طويل الطول ، مما يزيد من القدرة على فصل الببتيدات بواسطة النقاط المتماثلة.
لبدء بناء العمود ، قم بتعليق 50 ملليغرام من مواد تعبئة تبادل الأنيون الضعيفة في 3.5 مل من 90٪ من الأيزوبروبانول في الماء. تأمين تركيب أنثى إلى أنثى ، ميكروفيرال ، وصمولة أنثوية في أحد طرفي طول 50 سم من أنابيب الذروة بقطر داخلي يبلغ 200 ميكرومتر. قم بتركيب شاشة 1/16 بوصة مع مسام ميكرومتر واحد في نهاية الأنبوب داخل microferal.
باستخدام مضخة الضغط التي تم ضبطها على 4 ، 500 رطل لكل بوصة مربعة ، قم بتعبئة تبادل الأنيون في الشعيرات الدموية حتى تصبح المادة مرئية في الأعلى. قم بإرفاق تركيبات أخرى من أنثى إلى أنثى ، وميكروفيرال ، وأنثى بالجزء العلوي من الشعيرات الدموية المعبأة في الطرف المقابل لإنهاء تجميع العمود. اغسل 50 إلى 100 ملليغرام من الأنسجة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات لمدة خمس دقائق.
كرر هذا الغسيل مرتين ، ثم ضع المنديل المغسول في أنابيب بأغطية أمان. أضف إلى كل أنبوب وزنا واحدا يعادل حبات الفولاذ المقاوم للصدأ ، و 2.5 ما يعادل حجم محلول مائي 100 مللي مولار من أسيتات الأمونيوم مع 1٪ ديوكسيكولات الصوديوم. تجانس الأنسجة بأقصى كثافة لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.
ثم ، قم بالطرد المركزي المتجانس لمدة عشر دقائق عند 10 ، 000 × جم وأربع درجات مئوية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. استمر في تجانس وطرد بيليه الأنسجة ، والجمع بين المواد الطافية في كل مرة حتى لا يلاحظ أي بيليه.
حدد تركيز البروتين في المواد الطاففية المركبة باستخدام مقايسة حمض البيسنشونيك. بعد ذلك ، أضف إلى التجانس محلول مولاري واحد من dithiothreitol في 100 مللي مولار أسيتات الأمونيوم للوصول إلى تركيز عشرة مللي مولار dithiothreitol في العينة. احتضان الجانس في حمام مائي عند 60 درجة مئوية لمدة ثلاثين دقيقة.
أضف إلى التجانس محلول مولاري واحد من اليودوأسيتاميد في 100 مللي مولار أسيتات الأمونيوم للوصول إلى تركيز 20 ملليمولار من اليودوأسيتاميد في العينة. احتضان الجانس في درجة حرارة الغرفة في حالة عدم وجود ضوء لمدة 45 دقيقة. ثم قم بتخفيف الجانس بمكافئين حجميين لمحلول عشرة مللي مولار من ثنائي ثيوثريتول في 100 مللي مولار أسيتات الأمونيوم.
احتضان الجانس عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. أضف إلى التجانس حجما كافيا من التربسين المعدل بدرجة التسلسل في 100 مللي مولار أسيتات الأمونيوم لتحقيق نسبة إنزيم بروتين من 1 إلى 50 بالوزن في العينة. احتضان العينة عند 30 درجة مئوية طوال الليل لهضم المتجانس.
قم بإخماد عملية الهضم بنسبة 0.5٪ من وزن عينة حمض الفورميك ، مما يؤدي إلى ترسيب أملاح ديوكسي كولات الصوديوم. قم بتدوير العينات التي تحتوي على أملاح SDC برفق ثم قم بالطرد المركزي للعينات لمدة عشر دقائق عند 12،000 × جم وأربع درجات مئوية. صب المادة الطافية في أنبوب جديد ، مع الحرص على عدم إزعاج حبيبات أملاح SDC.
أعد إذابة الأملاح في محلول مائي 0.5٪ من حيث الحجم من هيدروكسيد الأمونيوم ، مع دوامة قوية. قم بتكييف خرطوشة ماصة C-18 بوزن جرام واحد ب 5 ملليلتر من الأسيتونيتريل ، متبوعة بخمسة ملليلتر من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك 0.1٪ في الماء. ثم قم بتحميل العينة المهضومة على الخرطوشة.
اغسل العينات ثلاث إلى خمس مرات بخمسة مليلتر من 0.1٪ TFA. ثم قم بتخفيف الببتيدات بخمسة ملليلتر من محلول مائي 75٪ أسيتونيتريل و 0.1٪ حمض الفورميك. جفف السائل في مكثف فراغ.
أضف 200 ميكرولتر من الأسيتونيتريل 75٪ ، مع 0.1٪ حمض الفورميك إلى البقايا. دوامة الخليط لمدة عشر دقائق على الأقل ، ثم صوتنة الخليط لمدة 30 دقيقة على الأقل لإعادة تكوين الببتيدات الجافة. خفف العينة حسب الحاجة ، بحيث تحتوي العينة المحقونة على ميكروغرام إلى ثلاثة ميكروغرام من البروتين.
قم بتوصيل العمود الشعري LAX بأداة كروماتوغرافيا سائلة ذات ضغط عال للغاية. تحضير محاليل حمض الفورميك 0.1٪ في الماء والأسيتونيتريل. اضبط معدل التدفق على 0.4 ميكرولتر في الدقيقة ، وقم بإعداد تشغيل متدرج لمدة 1 ، 200 دقيقة.
قم بتكوين أحداث مسح مطياف الكتلة لإجراء الحصول على البيانات بالتناوب ، بين قياس الطيف الكتلي لتحويل فورييه الكامل وقياس الطيف الكتلي الترادفي لتحويل فورييه. قم بإجراء LERLIC MS / MS لفصل وتوصيف الببتيدات. استخدم البيانات الناتجة والبرامج البروتينية لإجراء بحث في قاعدة بيانات البروتين.
تصدير نتائج البحث في قاعدة البيانات إلى برنامج جداول البيانات. تحديد واستخراج قائمة الببتيدات منزوعة الدقة والببتيدات غير المضادة للببتيدات المقابلة. استخرج الكروماتغرامات الأيونية لكل من هذه الببتيدات بخمسة أجزاء في المليون من تحمل الكتلة.
افحص الكروماتغرامات الأيونية المستخرجة بحثا عن وهم الذروة المزدوجة المنفصلة للمنتجات الأيزومرية. باستخدام LERLIC MS / MS ، تم فصل الأشكال الإسوية منزوعة الأمين للجلوتامين والأسباراجين وتحديدها من عينة بروتين في وقتين مختلفين للاحتفاظ. تم تحديد بقايا الجلوتامين الوسيطة المعدلة إنزيميا من الترانس أظهرت نسبة جاما ألفا جلوتاميل مقلوبة.
كما تم تحديد وسيط السكسينيميد في بقايا الهليون بهذه الطريقة. نظرا لأن ظروف معالجة العينة الحمضية المعتدلة تعمل على استقرار وسيط السكسينيميد. يشير هذا إلى أنه يمكن تطبيق تقنية LERLIC MS / MS على دراسة البروتيوم الواسعة للمواد الوسيطة السكسينيميد.
بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في الكيمياء الحيوية لتوصيف إزالة البروتين في سياقات تتراوح من علم الآثار إلى البحوث الطبية الحيوية.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة منهجية جديدة تسمى كروماتوغرافيا التنافر الكهروستاتيكي الطويلة المدى - التفاعل الهيدروفيلي - مطيافية الكتلة الترادفية (LERLIC-MS/MS). تسمح هذه الطريقة بتحديد كمية وتوصيف أشكال التخليق المختلفة للجلوتامين والأسباراجين باستخدام بروتيوميات الطلقات العشوائية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الكيمياء الحيوية
- بروتيوميات
- مطيافية الكتلة
الخلفية
- منتجات التخليق الذاتي للجلوتامين والأسباراجين مهمة في العديد من العمليات الكيميائية الحيوية.
- يمكن أن يوفر توصيف هذه المنتجات رؤى حول أدوارها في البروتيوميات المعقدة.
- قد لا تعمل الطرق التقليدية على فصل أيزومرات التنعيم بشكل فعال.
- بروتيوميات الطلقات العشوائية هي تقنية قوية لتحليل المخاليط المعقدة.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة لتحديد كمية وتوصيف أشكال التخليق المختلفة.
- تحسين فصل أيزومرات تنعيم الجلوتامين.
- معالجة الأسئلة الرئيسية في الكيمياء الحيوية المتعلقة بعمليات التنعيم.
الطرق المستخدمة
- بناء عمود شعري للتغير الأيوني طويل الطول.
- تعليق مادة حشو تبادل الأنيونات الضعيف في الأيزوبروبانول والماء.
- استخدام بروتيوميات الطلقات العشوائية للتحليل.
- فصل الببتيدات على أساس النقاط المتساوية القياس.
النتائج الرئيسية
- نجحت طريقة LERLIC-MS/MS في تحديد كمية أشكال التخليق المختلفة.
- تم تحقيق فصل أفضل لمنتجات تنعيم الجلوتامين والأسباراجين.
- توفر هذه المنهجية رؤى جديدة حول العمليات الكيميائية الحيوية التي تتضمن هذه الأحماض الأمينية.
- تم تحديد تطبيقات محتملة في فهم البروتيوميات المعقدة.
الاستنتاجات
- LERLIC-MS/MS هي أداة قيّمة لدراسة أشكال التخليق المختلفة.
- تعزز المنهجية فهم أدوار الجلوتامين والأسباراجين في الكيمياء الحيوية.
- يمكن للبحوث المستقبلية أن تبني على هذه المنهجية لاستكشاف أسئلة كيميائية حيوية أخرى.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Characterizing glutamine and asparagine deamidation is critical for understanding protein stability and function in disease contexts, yet current methods lack the resolution to separate and quantify these isoforms in complex proteomes. The LERLIC-MS/MS method addresses this gap by enabling isoform-specific detection, supporting mechanistic de-risking in target validation and improving predictive confidence in preclinical models. This capability enhances translational continuity by linking molecular PTM patterns to functional outcomes across discovery stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of glutamine and asparagine deamidation as potential regulators of protein function in disease-relevant systems.
- Operational Value: Provides isoform-resolved data that clarifies whether observed PTMs are enzymatically driven or spontaneous, reducing mechanistic ambiguity.
- Predictive Value: Supports target confidence by distinguishing functional deamidation events from background noise in complex biological samples.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, retention-time-resolved readouts for deamidated peptides, enabling reliable detection in screening campaigns.
- Operational Value: Delivers reproducible separation of isobaric isoforms, improving assay precision and reducing false positives in PTM-focused screens.
- Scalability: Compatible with shotgun proteomics workflows, allowing application to complex biological matrices without prior enrichment.
Translational & Preclinical Research
- Translational Biomarker Alignment: Facilitates identification of deamidation patterns that correlate with disease states or therapeutic response in preclinical models.
- Mechanistic De-risking: Stabilizes and detects the succinimide intermediate, enabling direct observation of deamidation reaction pathways for kinetic and mechanistic studies.
- Preclinical Model Relevance: Supports disease-relevant systems by characterizing PTM landscapes in tissues or cells under pathophysiological conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The LERLIC-MS/MS method fits within the discovery continuum from early target validation through preclinical evaluation, particularly where PTM heterogeneity impacts target function or biomarker reliability.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by determining whether specific glutamine or asparagine sites undergo deamidation in disease vs. control conditions.
- Screening: Enables assay-ready detection of deamidation isoforms with chromatographic separation, improving selectivity in complex lysates.
- Analytics: Provides extracted ion chromatograms and retention time shifts that allow quantitative comparison of deamidation levels across experimental conditions.
- Translational Research: Connects PTM detection to functional outcomes by linking deamidation events to changes in protein activity or stability in disease models.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable proteomics platform applicable across multiple targets, disease areas, and sample types without reformulation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in PTM analysis by resolving isobaric glutamine and asparagine deamidation products that conventional methods cannot distinguish.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized column chemistry and sample processing that stabilizes labile intermediates like succinimide.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing mechanistic insight into PTM-driven target instability or loss of function.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on deamidation susceptibility and functional consequence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomics sample preparation, chromatographic method development, and mass spectrometry data interpretation.
- Dependent on ultra-high pressure liquid chromatography and high-resolution mass spectrometry instrumentation capable of long-gradient separations.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling to prevent artifactual deamidation during preparation.
- Adaptation to different model systems may require optimization of lysis and digestion conditions to preserve endogenous PTM states.
- Practical limitations include longer run times (up to 1,200 minutes) and the need for specialized column packing expertise, which may affect throughput in high-volume settings.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
Long-length Anion-exchange (LAX) Capillary Column Packing
1:43
Tissue Sample Preparation
5:33
One-dimension Long-length Electrostatic Repulsion-hydrophilic Interaction Chromatography-tandem Mass Spectrometry (LERLIC-MS/MS) Separation and Data Analysis
6:48
Results: Separation of Deamidation Isoforms of Glutamine and Asparagine by LERLIC-MS/MS
7:34
Conclusion
