LERLIC-MS / MS للمتعمقة توصيف والكمي لالجلوتامين والهليونين نزع الأميد في البندقية البروتيوميات

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام البروتيوميات الشاملة (shotgun proteomics) لتوصيف وقياس نواتج نزع الأمين الداخلية من الجلوتامين والأسباراجين في البروتيومات المعقدة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في الكيمياء الحيوية، مثل تأثير العمليات التلقائية وغير التلقائية على النواتج المتصاوغة لعملية نزع الأمين من الجلوتامين والأسباراجين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن متصاوغات نزع أمين الجلوتامين يتم فصلها باستخدام عمود شعري طويل للتبادل الأيوني، مما يزيد من القدرة على فصل الببتيدات بناءً على نقاط التصاوغ.

لبدء بناء العمود، قم بتعليق 50 milligrams من مادة حشو التبادل الأنيوني الضعيف في 3.5 milliliters من 90%isopropanol في الماء. قم بتثبيت وصلة أنثى إلى أنثى، وmicroferal، وصامولة أنثى عند أحد طرفي أنبوب peak بطول 50 centimeter وقطر داخلي يبلغ 200 micrometers. قم بتركيب مصفاة بمقاس 1/16th inch ذات مسام بحجم one micrometer عند نهاية الأنبوب داخل الـ microferal.

باستخدام مضخة ضغط مضبوطة على 4,500 psi، قم بتعبئة مادة التبادل الأنيوني في الشعيرة حتى تصبح المادة مرئية عند القمة. قم بتثبيت وصلة أخرى (أنثى إلى أنثى)، وحلقة إغلاق دقيقة (microferal)، وصامولة أنثى في الجزء العلوي من الشعيرة المعبأة عند الطرف المقابل لإنهاء تجميع العمود. اغسل من 50 إلى 100 مليغرام من النسيج باستخدام محلول ملحي منظم بالفوسفات لمدة خمس دقائق.

كرر عملية الغسل هذه مرتين، ثم ضع الأنسجة المغسولة في أنابيب ذات أغطية أمان. أضف إلى كل أنبوب كمية مساوية من حيث الوزن من حبيبات الفولاذ المقاوم للصدأ، و2.5 مكافئ من حيث الحجم من محلول مائي بتركيز 100 millimolar من خلات الأمونيوم مع 1% sodium deoxycholate. قم بتجانس الأنسجة بأقصى شدة لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة أربع درجات Celsius.

بعد ذلك، قم بطرد متجانس العينة مركزياً لمدة عشر دقائق عند 10,000 x g ودرجة حرارة أربع درجات مئوية. انقل الراشح إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. استمر في تجنيس وطرد كُتلة النسيج المترسبة مركزياً، مع تجميع الراشحات في كل مرة حتى لا يُلاحظ وجود أي رواسب.

قم بقياس تركيز البروتين في الرواسب العلوية المجمعة باستخدام مقايسة حمض البيكينشونينيك. بعد ذلك، أضف إلى المتجانس محلولاً تركيزه 1 M من dithiothreitol في 100 mM من ammonium acetate للوصول إلى تركيز 10 mM من dithiothreitol في العينة. قم بحضن المتجانس في حمام مائي عند درجة حرارة 60 °C لمدة ثلاثين دقيقة.

أضف إلى المتجانس محلول يودوأسيتاميد بتركيز 1 مولار في خلات الأمونيوم بتركيز 100 ملي مولار، وذلك للوصول إلى تركيز 20 ملي مولار من اليودوأسيتاميد في العينة. قم بتحضين المتجانس في درجة حرارة الغرفة بعيداً عن الضوء لمدة 45 دقيقة. ثم خفف المتجانس بإضافة ما يعادل ضعفي الحجم من محلول ديثيوثريتول بتركيز 10 ملي مولار في خلات الأمونيوم بتركيز 100 ملي مولار.

يُحضن المتجانس عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. يُضاف إلى المتجانس حجم كافٍ من modified trypsin بدرجة sequencing في 100 millimolar من خلات الأمونيوم لتحقيق نسبة بروتين إلى إنزيم تبلغ 1 إلى 50 بالوزن في العينة. تُحضن العينة عند 30 درجة مئوية طوال الليل لهضم المتجانس.

أوقف عملية الهضم بإضافة حمض الفورميك بنسبة 0.5% من وزن العينة، مما يؤدي إلى ترسيب أملاح ديوكسيكولات الصوديوم. قم برج العينات التي تحتوي على أملاح SDC برفق باستخدام جهاز الـ vortex، ثم قم بطرد العينات مركزياً لمدة عشر دقائق عند 12,000 x g ودرجة حرارة أربع درجات مئوية. صب السائل الطافي في أنبوب جديد، مع الحرص على عدم تعكير راسب أملاح SDC.

أعد إذابة الأملاح في محلول مائي من هيدروكسيد الأمونيوم بتركيز 0.5% من حيث الحجم، مع الرج القوي باستخدام جهاز vortex. قم بتهيئة خرطوشة امتزاز C-18 سعة جرام واحد باستخدام 5 milliliters من الأسيتونيتريل، يليه خمس milliliters من حمض trifluoroacetic بتركيز 0.1% في الماء. بعد ذلك، قم بتحميل العينة المهضومة على الخرطوشة.

اغسل العينات من ثلاث إلى خمس مرات باستخدام حصص سعة 5 ml من 0.1% TFA. ثم خفف الببتيدات باستخدام 5 ml من محلول مائي يتكون من 75% acetonitrile و 0.1% formic acid. وجفف السائل في مكثف تفريغ.

أضف 200 µL من الأسيتونيتريل بنسبة 75%، مع 0.1% حمض الفورميك إلى الرواسب. قم برج الخليط باستخدام جهاز vortex لمدة عشر دقائق على الأقل، ثم استخدم الموجات فوق الصوتونية (sonication) للخليط لمدة 30 دقيقة على الأقل لإعادة تكوين الببتيدات المجففة. خفف العينة حسب الحاجة، بحيث تحتوي العينة المحقونة على 1 إلى 3 µg من البروتين.

قم بتوصيل عمود LAX الشعري بجهاز كروماطوغرافيا سائلة فائقة الأداء وعالية الضغط. قم بتحضير محاليل حمض الفورميك بتركيز 0.1% في الماء والأسيتونيتريل. اضبط معدل التدفق على 0.4 microliters per minute، وقم بإعداد تشغيل متدرج لمدة 1,200 دقيقة.

قم بتكوين أحداث مسح مطياف الكتلة لتبادل الحصول على البيانات بين مطياف الكتلة بتحويل فورير الكامل ومطياف الكتلة الترادفي بتحويل فورير. قم بإجراء تحليل LERLIC MS/MS لفصل الببتيدات وتوصيفها. استخدم البيانات الناتجة وبرمجيات البروتوميات لإجراء بحث في قاعدة بيانات البروتينات.

قم بتصدير نتائج البحث في قاعدة البيانات إلى برنامج جداول البيانات. حدد واستخرج قائمة الببتيدات منزوعة الأميد (deamidated peptides) والببتيدات المقابلة لها غير منزوعة الأميد. استخرج مخططات الكروماتوغرام الأيوني لكل ببتيد من هذه الببتيدات مع سماحية كتلة تبلغ five parts per million.

افحص الكروماتوجرامات الأيونية المستخرجة للبحث عن وهم القمم المزدوجة المنفصلة للنواتج المتصاوغة. وبـاستخدام LERLIC MS/MS، تم فصل وتحديد الأشكال المتصاوغة منزوعة الأميد للجلوتامين والأسباراجين من عينة بروتينية عند وقتين مختلفين للاحتجاز. كما تم تحديد بقايا الجلوتامين الوسيطة المعدلة إنزيمياً لعملية نقل الأميد، والتي أظهرت نسبة عكسية من غاما ألفا جلوتاميل.

تم أيضاً تحديد وسيط السكسينيميد في بقايا الأسباراجين باستخدام هذه الطريقة. حيث تعمل ظروف معالجة العينة الحمضية الخفيفة على استقرار وسيط السكسينيميد. وهذا يشير إلى إمكانية تطبيق تقنية LERLIC MS/MS في دراسة وسائط السكسينيميد على نطاق البروتوم الكامل.

بعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في الكيمياء الحيوية لتوصيف عملية نزع الأميد من البروتين في سياقات تتراوح من علم الآثار إلى الأبحاث الطبية الحيوية.