البروتيوميات الكمي عن طريق انتقاصية Dimethylation لمستقر النظائر وصفها

الهدف العام من هذا الإجراء هو مقارنة تركيزات العديد من البروتينات بين العينات عن طريق قياس الطيف الكتلي باستخدام البروتينات الجاهزة. يتم تحقيق ذلك عن طريق هضم البروتين أولا من كل عينة لتوليد مخاليط الببتيد. بعد ذلك ، يتم خلط العينتين ، ويتم تجزئة الببتيدات في العينة المختلطة وتحلىها.

بعد ذلك ، يتم تحليل العينة المختلطة بواسطة قياس الطيف الكتلي. أخيرا ، يتم تحديد الببتيدات من خلال مقارنة طيف MS اثنين بقاعدة بيانات شرك مستهدفة لجميع الببتيدات المحتملة في العينات ويتم تحديد الوفرة النسبية للببتيدات بين العينات. في النهاية ، تتيح البروتينات الجاهزة التقدير الكمي للوفرة النسبية للعديد من البروتينات بين العينات المعقدة.

تتمثل المزايا الرئيسية لإزالة الميثيل المختزل على الطرق الأخرى لوضع العلامات على النظائر المستقرة مثل iLite في أن الجاهزة هي طريقة سريعة وغير مكلفة ودقيقة لا تتطلب trois محددا أو وسيطا اصطناعيا ، مما يعني أنه يمكن تطبيقها على أي نوع من العينات تقريبا. للبدء ، قم بإعداد مليغرام واحد من البروتين الخلوي و 500 ميكرولتر باستخدام صوتنة أو مكبس فرنسي لتجميع الخلايا لترسيب البروتينات. أضف حجما واحدا من حمض الكلوروتيك الثلاثي إلى أربعة أحجام من البروتين واتركه يبرد على الثلج لمدة 10 دقائق.

جهاز طرد مركزي عند 12 ، 000 جي ثانية لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وإزالة المادة الطافية. ثم استخدم ملليلتر واحد من الأسيتون المثلج إلى Resus. الحبيبات قبل الدوران مرة ثانية.

بعد شفط snat, جفف الحبيبات في كتلة حرارية 56 درجة مئوية لتشويه طبيعة البروتينات وتقليل روابط كبريتيد الصبغة. استخدم 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتغيير الطبيعة والتقليل لعملية إعادة الإنتاج. أعد تعليق البروتينات إلى ما يقرب من ملليغرام لكل ملليلتر.

احتضان البروتينات لمدة 30 دقيقة عند 56 درجة مئوية ، تليها 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بجانب مجموعات الكبريتيد الخالي من الألكيلات ، أضف 25 ميكرولترا من أسيتاميد IDO 0.3 مولار المحضر حديثا في الماء إلى 500 ميكرولتر من البروتين واحتضنه في الظلام لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، قم بإخماد التفاعل بإضافة 10 ميكرولتر من ثلاثة مللي مولار DTT.

قم بتخزين البروتينات المؤلكلة عند سالب 80 درجة مئوية لهضم البروتينات المؤلكلة بعد ترسيب TCA ، استخدم يوريا مولية واحدة في 50 ملليمولار ، ودرجة الحموضة 8.2 لإعادة تعليق البروتين. قم بإعداد محلول مخزون من Lysol أو endo proteinase أو ly C في الماء بتركيز ميكروغرامين لكل ميكرولتر وإضافة الإنزيم إلى البروتين المهضوم بتركيز نهائي قدره 10 نانوجرام لكل ميكرولتر تترك العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة ست ساعات أو بين عشية وضحاها. 20 ميكروغراما من التربسين من درجة التسلسل في 40 ميكرولترا من 50 ملليمولار حمض الأسيتيك وأضف خمسة ميكرولترات إلى تفاعل هضم الليس.

احتضان لمدة ست ساعات عند 37 درجة مئوية للبروتينات المؤلكلة. أضف حمض الخليك ثلاثي الفلور أو TFA إلى التركيز النهائي بنسبة 0.5٪ قم بتوصيل عمود C 18 بمشعب استخراج. ثم استخدم ستة ملليلتر من نتريل الأسيتو أو CN لترطيب العمود.

بعد ذلك ، مع أعلى معدل تدفق ممكن ، استخدم ستة ملليلتر من 80٪ CN 0.1٪ TFA لغسل العمود قبل استخدام ستة ملليلتر من 0.1٪ TFA لموازنة العمود ، وإيقاف ضغط الفراغ وتحميل 500 ميكروغرام من الببتيدات على العمود بمعدل تدفق يبلغ حوالي مليلتر واحد في الدقيقة. بمجرد ربط الببتيدات بالعمود ، أعد تشغيل الفراغ وبأعلى معدل تدفق ممكن ، استخدم 0.1٪ TFA متبوعا بثلاثة ملليلتر من عازلة حامض الستريك لغسل العمود لإجراء المثيلة اللاصقة أو المختزلة أو الخافتة أو الملصقات الجاهزة. تحت غطاء كيميائي ، قم بإعداد 12 مل لكل من المخازن الجاهزة الخفيفة والثقيلة خالية من الببتيد Tom Methylate.

أ يعني إضافة 10 ملليلتر من المخزن المؤقت الجاهز الخفيف أو الثقيل إلى العمود بمعدل تدفق واحد مليلتر في الدقيقة. بعد تطبيق ثانية 10 ملليلتر. لضمان وضع العلامات ، استخدم ستة ملليلتر من 0.1٪ TFA ، متبوعا بمليلتر واحد من حمض الأسيتيك 0.5٪.

لغسل العمود لتصفية البروتينات ، أوقف الفراغ وقم بتطبيق مليلتر واحد بنسبة 40٪ على حمض الخليك CN 0.5٪ بمعدل تدفق 0.5 مل في الدقيقة. ثم أضف ملليلتر واحد من 80٪ CN 0.5٪ حمض الخليك مع حقنة خمسة ملليلتر إذا رغبت في ذلك. امزج نسبة واحد إلى واحد من عينات الببتيد الثقيلة والخفيفة وقم بتحديدها عن طريق قياس الطيف الكتلي للتأكد من أن كلا من الملصقات الخفيفة كانت فعالة لتجزئة خليط الببتيد عن طريق تطبيقه أولا على عمود C 18 HPLC.

ثم بعد استخدام 5٪ a CN لغسل العمود لمدة خمس دقائق ، استخدم تدرجا من خمسة إلى 35٪ CN على مدار 60 دقيقة لمسح الببتيدات في كسور متساوية. في لوحة 96 بئر ، متبوعة ب 90٪ CN لمدة دقيقة واحدة. بعد أربع دقائق إضافية من 90٪ A CN ، استخدم 5٪ a CN لإعادة موازنة العمود.

ثم اجمع الكسور بالطريقة التالية مع جهاز الطرد المركزي الفراغي. قم بإزالة المذيب من الكسور المجمعة. ثم استخدم 130 ميكرولترا من اليوريا المولية 0.5٪ TFA إلى Resus.

قم بتعليق الببتيدات من الكسور التالية ، وقم بتخزين مجموعة الكسور عند سالب 20 درجة مئوية لإجراء الاستخراج والتوقف والانتقال على الكسور المعلقة. قم بإعداد أعمدة صغيرة ذات طرف C 18 المرحلة من أطراف ماصة سعة 200 ميكرولتر باستخدام قرصين C 18 بقطر داخلي يبلغ 1.07 ملم لتعبئتها. ضع أطراف المرحلة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وأضف 130 ميكرولترا من الميثانول وتدور.

ثم أضف 130 ميكرولتر من 80٪ CN 0.5٪ حمض الأسيتيك قبل الدوران مرة أخرى بعد استخدام 130 ميكرولتر من 0.1٪ TFA لموازنة الأطراف ، ونقل خليط الببتيد إلى الأطراف وغسلها. أولا مع 130 ميكرولتر من 0.1٪ TFA متبوعا ب 40 ميكرولتر من 0.1٪ TFA. ثم 40 ميكرولتر من حمض الأسيتيك 0.5٪ لتصفية الببتيدات.

أولا ، أضف 20 ميكرولترا من 40٪ إلى CN 0.5٪ حمض الأسيتيك. ثم 20 ميكرولتر من 80٪ CN 0.5٪ حمض الخليك. اجمع بين IITs والترشيح بالفراغ حتى يجف لإجراء كروماتوغرافيا سائلة شعرية دقيقة.

يبدأ قياس الطيف الكتلي الترادفي أو L-C-M-S-M-S باستخدام 5٪ حمض الفورميك ، 5٪ A CN لإعادة تعليق البروتينات إلى تركيز ميكروغرام واحد تقريبا لكل ميكرولتر. ضع ما يقرب من ميكروغرام واحد من الببتيدات على 100 ميكرومتر × 20 سم C 18. عمود HPLC عكسي الطور وقم بإزالته باستخدام تدرج ستة إلى 22٪ من CN في 0.1 25٪ حمض الفورميك بمعدل تدفق يبلغ حوالي 300 نانولتر في الدقيقة ، يتم تطبيقه على مدى 75 إلى 100 دقيقة.

استخدم مطياف الكتلة بدقة عالية ودقة كتلة عالية وحدد الببتيدات في العينة من خلال مقارنة ملفات Spectra الأولية Ms.Ms بقاعدة بيانات نظرية باستخدام خوارزمية مثل SE quest ، باستخدام المعلمات الموضحة هنا مع قاعدة بيانات إطارات القراءة المفتوحة في الاتجاهات الفعلية والعكسية لتصفية الببتيدات إلى معدل اكتشاف خاطئ بنسبة 1٪ باستخدام طريقة مثل الشرك المستهدف. لتحديد كمية الببتيدات المحددة ، احسب مساحات الأزواج الثقيلة والخفيفة من MS واحد الكروماتوغرامات الأيونية المستخرجة ونسب إشارة الببتيد إلى الضوضاء تشمل أزواج الببتيد فقط عندما يكون متوسط نسبة الإشارة إلى الضوضاء أعلى من خمسة. حدد الوفرة النسبية للببتيد في العينتين كنسبة MS ، ومناطق الذروة الواحدة للإصدارات الثقيلة والخفيفة من نفس الببتيد ، وحساب وفرة البروتين النسبية مثل متوسط نسبة مساحة الذروة الواحدة ل MS لجميع الببتيدات في البروتين عند ترشيحها إلى معدل اكتشاف خاطئ للببتيد بنسبة 1٪.

كفاءة وضع العلامات الجاهزة لمزيج من تخمير c phyto من الثقافات الثقيلة والخفيفة التي تحتوي على 11 ، 194 تسلسلا فريدا من الببتيد 98٪ تم تحليل محللة البروتين المرئي غير المجزأة بالمثل. تعكس اختلافات تعبير البروتين بشكل متكرر النسب التي تم خلط العينات الثقيلة والخفيفة عبر مجموعة واسعة من نسب الخلط. على وجه التحديد ، كان تغيير fo ل 99٪ من البروتينات أصغر من 1.6 للعينات المختلطة الفردية في العينات الواحدة إلى 10 و 10 إلى واحدة.

كانت 99٪ من البروتينات في حدود 3.8 أضعاف النسبة المتوقعة مما يدل على زيادة في الانحراف المعياري على مسافة أكبر من خليط واحد إلى واحد. عندما تم تطبيق الملصقات الجاهزة على بروتين تخمير المطثية النباتية ، تم قياس أكثر من 2000 بروتين بنسبة 94٪ تم قياسها ضمن مستويات مزدوجة للثقافات المكررة التي تنمو على طية بروتين الجلوكوز. كما كانت التغييرات في أزواج الثقافات المكررة مرتبطة ارتباطا وثيقا.

هذه التجارب معا أن البروتينات الجاهزة هي طريقة دقيقة وقابلة للتكرار لتحديد اختلافات تعبير البروتين بين العينات المعقدة. نظرا لأنه يمكن تطبيق هذه التقنية على أي نوع من العينات تقريبا ، فقد مهدت الطريق للباحثين في مجال البروتينات لاستكشاف تغيرات التعبير البروتيني في جميع أنواع العينات ، بما في ذلك الميكروبات الجديدة والأسماك وخلايا الثدييات.