البروتيوميات الكمي عن طريق انتقاصية Dimethylation لمستقر النظائر وصفها

الهدف العام من هذا الإجراء هو مقارنة تركيزات العديد من البروتينات بين العينات عن طريق قياس الطيف الكتلي باستخدام البروتيوميات الجاهزة. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق هضم البروتين من كل عينة لتوليد مخاليط ببتيدية. بعد ذلك، يتم خلط العينتين، ثم تجزئة الببتيدات في العينة المختلطة وإزالة الأملاح منها.

بعد ذلك، يتم تحليل العينة المختلطة بواسطة مطيافية الكتلة. وأخيراً، يتم تحديد الببتيدات من خلال مقارنة أطياف MS two بقاعدة بيانات هدف وهمية (target decoy database) لجميع الببتيدات المحتملة في العينات، ويتم قياس الوفرة النسبية للببتيدات بين العينات. وفي النهاية، تتيح البروتوميات الجاهزة (ready proteomics) قياس الوفرة النسبية للعديد من البروتينات بين العينات المعقدة.

تتمثل المزايا الرئيسية لإزالة الميثيل الاختزالية مقارنة بطرق وسم النظائر المستقرة الأخرى، مثل iLite، في أنها طريقة سريعة وغير مكلفة ودقيقة ولا تتطلب وسطاً خاصاً أو وسطاً اصطناعياً، مما يعني إمكانية تطبيقها على أي نوع من العينات تقريباً. للبدء، قم بتحضير 1 mg من البروتين الخلوي و 500 µL باستخدام الموجات فوق الصوتية أو المكبس الفرنسي (French press) لتحليل الخلايا لترسيب البروتينات. أضف حجماً واحداً من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك إلى أربعة أحجام من البروتين، ثم برد المزيج على الثلج لمدة 10 دقائق.

يتم الطرد المركزي عند 12,000 Gs لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة أربع درجات Celsius ثم يُزال الطافي. بعد ذلك، يُستخدم 1 mL من الأسيتون المبرد بالثلج لإعادة تعليق الراسب قبل إجراء عملية الطرد المركزي مرة ثانية.

بعد سحب السائل العلوي، جفف الراسب في حمام مائي حراري عند درجة حرارة 56 °C لتمسخ البروتينات وتقليل روابط ديسلفيد الصبغة. استخدم 500 µL من منظم المسخ والاختزال لإعادة التعليق. أعد تعليق البروتينات بتركيز تقريبي يبلغ 2 mg/mL.

يتم تحضين البروتينات لمدة 30 دقيقة عند 56 °C، تليها 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ولألكلة مجموعات السلفيد الحرة، أضف 25 µL من IDO acetamide بتركيز 0.3 molar المحضر حديثاً في الماء إلى 500 µL من البروتين، ثم يتم التحضين في الظلام لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وبعد انتهاء التحضين، يتم إيقاف التفاعل بإضافة 10 µL من DTT بتركيز 3 millimolar.

تُخزن البروتينات المألكلة عند درجة حرارة 80- درجة مئوية. ولهضم البروتينات المألكلة بعد الترسيب باستخدام TCA، استخدم urea بتركيز 1 molar في heis بتركيز 50 millimolar وبدرجة pH 8.2 لإعادة تعليق البروتين. قم بتحضير محلول مخزون من Lysol، أو endo proteinase، أو ly C في الماء بتركيز 2 µg/µL، وأضف الإنزيم إلى البروتين المهضوم بتركيز نهائي قدره 10 ng/µL. تُترك العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة ست ساعات أو طوال الليل. قم بتعليق 20 µg من trypsin بدرجة نقاء مخصصة للتسلسل (sequencing grade) في 40 µL من حمض الأسيتيك بتركيز 50 millimolar، وأضف 5 µL إلى تفاعل هضم lyce.

يُحضن المزيج لمدة ست ساعات عند 37 درجة مئوية لألكلة البروتينات. يُضاف حمض ثلاثي فلورو الأسيتيك أو TFA ليصل التركيز النهائي إلى 0.5%. ثبّت عمود C 18 في مجمع استخلاص، ثم استخدم 6 مل من الأسيتونيتريل أو ACN لترطيب العمود.

بعد ذلك، وبأقصى معدل تدفق ممكن، استخدم 6 mL من 80% CN 0.1% TFA لغسل العمود، ثم استخدم 6 mL من 0.1% TFA لموازنة العمود، ثم أوقف ضغط التفريغ وقم بتحميل 500 µg من الببتيدات على العمود بمعدل تدفق يقارب 1 mL/min. وبمجرد ارتباط الببتيدات بالعمود، أعد تشغيل التفريغ وبأقصى معدل تدفق ممكن، استخدم 0.1% TFA متبوعاً بـ 3 mL من منظم حمض الستريك لغسل العمود من أجل إجراء عملية onco، أو reductive، أو dim methylation، أو ready labeling. وتحت غطاء سحب الغازات الكيميائية، قم بتحضير 12 mL من كل من المنظمات الجاهزة الخفيفة والثقيلة لعملية Tom Methylate peptide free.

أضف 10 ملليلتر من المنظم الجاهز، سواء كان الخفيف أو الثقيل، إلى العمود بمعدل تدفق قدره 1 ملليلتر في الدقيقة. وبعد تطبيق حصة ثانية بحجم 10 ملليلتر، ولضمان عملية الوسم، استخدم 6 ملليلتر من 0.1%TFA، يليه 1 ملليلتر من 0.5%acetic acid.

لغسل العمود واستخلاص البروتينات، أوقف عملية التفريغ وطبّق 1 mL من 40% a CN 0.5% acetic acid بمعدل تدفق قدره 0.5 mL/min. ثم أضف 1 mL من 80% a CN 0.5% acetic acid واستخلص باستخدام حقنة سعة 5 mL إذا لزم الأمر. اخلط عينات الببتيد الموسومة بالوزن الثقيل والخفيف بنسبة واحد إلى واحد، وقم بالقياس الكمي باستخدام مطياف الكتلة للتأكد من فعالية كل من الوسم الثقيل والخفيف، ثم قم بفصل خليط الببتيد عن طريق تطبيقه أولاً على عمود C 18 HPLC.

بعد ذلك، استخدم 5%a CN لغسل العمود لمدة خمس دقائق، ثم استخدم تدرجاً من 5 إلى 35%a CN على مدار 60 دقيقة لشطف الببتيدات في أجزاء متساوية في لوحة ذات 96 بئراً، يتبع ذلك استخدام 90%A CN لمدة دقيقة واحدة. وبعد أربع دقائق إضافية من 90%A CN، استخدم 5%a CN لإعادة توازن العمود.

بعد ذلك، ادمج الكسور بالطريقة التالية باستخدام جهاز الطرد المركزي الفراغي. قم بإزالة المذيب من الكسور المدمجة. ثم استخدم 130 µL من اليوريا بتركيز 1 molar و 0.5% TFA لإعادة التعليق.

قم بتعليق الببتيدات من الأجزاء التالية، واحفظ مجموعة الأجزاء عند درجة حرارة -20 °C لإجراء استخلاص متقطع (stop and go extraction) على الأجزاء التي تمت إعادة تعليقها. جهّز أعمدة دقيقة من رؤوس الماصات سعة 200 µL من نوع C 18 stage tip باستخدام قرصين من C 18 بقطر داخلي يبلغ 1.07 mm لتعبئتها. ضع رؤوس الـ stage tips في أنابيب طرد مركزي دقيقة وأضف 130 µL من الميثانول ثم قم بالتدوير.

ثم أضف 130 µL من 80% CN 0.5%acetic acid قبل إجراء عملية الطرد المركزي مرة أخرى؛ وبعد استخدام 130 µL من 0.1%TFA لموازنة الرؤوس، انقل خليط الببتيد إلى الرؤوس واغسلها. ابدأ بـ 130 µL من 0.1%TFA يليه 40 µL من 0.1%TFA. ثم استخدم 40 µL من 0.5%acetic acid لاستخلاص الببتيدات.

أولاً، أضف 20 µL من 40% إلى CN 0.5% acetic acid. ثم أضف 20 µL من 80% إلى CN 0.5% acetic acid. ادمج عينات IITs وقم بإجراء ترشيح بالتفريغ للتجفيف من أجل تنفيذ الكروماتوغرافيا السائلة ذات الأنابيب الشعرية الدقيقة.

يبدأ تحليل طيف الكتلة الترادفي أو LC-MS/MS باستخدام حمض الفورميك 5% وACN 5% لإعادة تعليق البروتينات بتركيز يصل إلى 1 µg/µL تقريباً. يتم وضع 1 µg تقريباً من الببتيدات على عمود HPLC من نوع C18 ذو طور معكوس وبأبعاد 100 µm × 20 cm، ويتم الاستخلاص باستخدام تدرج من ACN بنسبة 6 إلى 22% في حمض فورميك 0.1% إلى 25% وبمعدل تدفق يبلغ 300 nL/min تقريباً، وذلك على مدار 75 إلى 100 دقيقة.

استخدم مطياف كتلة يتميز بدقة تحليلية عالية ودقة كتلة عالية، وقم بتحديد الببتيدات في العينة من خلال مقارنة ملفات MS/MS Spectra الخام بقاعدة بيانات نظرية باستخدام خوارزمية مثل SEquest، مع تطبيق المعلمات الموضحة هنا وقاعدة بيانات أطر القراءة المفتوحة بالاتجاهين الأصلي والعكسي، ثم قم بتصفية الببتيدات للوصول إلى معدل اكتشاف خاطئ بنسبة 1% باستخدام طريقة مثل target-decoy. ولتقدير كمية الببتيدات المحددة، احسب مساحات أزواج الأيونات الثقيلة والخفيفة في كروماتوغرامات الأيونات المستخلصة من MS1 ونسب الإشارة إلى الضجيج للببتيدات، مع إدراج أزواج الببتيدات فقط عندما يكون متوسط نسبة الإشارة إلى الضجيج أعلى من خمسة. قم بتقدير الوفرة النسبية للببتيد في العينتين كنسبة لمساحات قمم MS1 للإصدارات الثقيلة والخفيفة من الببتيد نفسه، واحسب الوفرة النسبية للبروتين كقيمة الوسيط لنسب مساحات قمم MS1 لجميع الببتيدات الموجودة في البروتين عند تصفيتها وفقاً لمعدل اكتشاف خاطئ للببتيدات بنسبة 1%.

بلغت كفاءة التوسيم الجاهزة لمزيج من تخمير c phyto من المزارع الموسومة بالكتلة الثقيلة والخفيفة، والتي تحتوي على 11,194 تسلسلاً ببتيدياً فريداً، 98%. كما تم تحليل مستخلص البروتين غير المجزأ من visier بطريقة مماثلة. وتعكس الاختلافات في التعبير البروتيني بشكل قابل للتكرار النسب التي تم بها خلط العينات الثقيلة والخفيفة عبر نطاق واسع من نسب الخلط. وعلى وجه التحديد، كان التغير في 99% من البروتينات أقل من 1.6 للعينات المختلطة بنسبة واحد إلى واحد، وفي العينات المختلطة بنسبة واحد إلى 10 و10 إلى واحد.

كانت 99% من البروتينات ضمن 3.8 ضعف النسبة المتوقعة، مما أظهر زيادة في الانحراف المعياري عند المسافات الأكبر من خليط بنسبة واحد إلى واحد. وعند تطبيق الوسم الجاهز على بروتيوم Clostridium phyto ferment، تم قياس كمية أكثر من 2000 بروتين، حيث تم قياس 94% من البروتينات ضمن مستويات ضعفين للمزارع المكررة التي نمت على وسط من الجلوكوز والبروتين. كما كانت التغييرات لأزواج المزارع المكررة مرتبطة بشكل وثيق.

تدعم هذه التجارب مجتمعة أن تقنية Ready proteomics هي طريقة دقيقة وقابلة للتكرار لقياس اختلافات التعبير البروتيني بين العينات المعقدة. وبما أن هذه التقنية يمكن تطبيقها على أي نوع من العينات تقريباً، فقد مهدت الطريق للباحثين في مجال البروتوميات لاستكشاف تغيرات التعبير البروتيني في كافة أنواع العينات، بما في ذلك الميكروبات المستحدثة، والأسماك، والخلايا الثديية.