عزل بروتينات الشعيرة المتوسطة من أنسجة الفئران المتعددة لدراسة التعديلات المرتبطة بالشيخوخة بعد الترجمة

الهدف العام من هذا الإجراء الكيميائي الحيوي هو عزل الأجزاء المخصبة بالخيوط الوسيطة من أنسجة الفئران المتعددة من أجل دراسة التعديلات اللاحقة للترجمة لبروتينات الخيوط الوسيطة الخاصة بالأنسجة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الخيوط الوسيطة مثل كيفية تأثر وظيفة وتنظيم هذه البروتينات الهيكلية الخلوية الهامة الواقية من الإجهاد أثناء شيخوخة الثدييات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن دمج خطوة تحلل الأنسجة الآلي يسمح للمستخدمين بمعالجة عينات متعددة من الأنسجة بطريقة سريعة وفعالة.

للبدء ، أضف ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت Triton X-100 المثلج البارد المكمل بمثبطات الإنزيم البروتيني في الخالط الأنبوبي الزجاجي وضعه على الثلج. قم بإزالة قطعة صغيرة من الأنسجة من تخزين النيتروجين السائل وضعها مباشرة في الخالط الزجاجي. ثم مع الاحتفاظ بالخالط والعينة على الجليد في جميع الأوقات ، استخدم ما يقرب من 50 ضربة من باستيل بولي تترافلورو إيثيلين لتجانس العينة مع تقليل تكوين الفقاعات.

انقل المحللة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل على الجليد ، وقم بالطرد المركزي للعينة عند 20،000 مرة جم في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، اجمع الجزء الطافي القابل للذوبان Triton X في أنبوب منفصل. يمكن استخدام هذا الجزء للترسيب المناعي وتحليل مجموعة بروتينات IF القابلة للذوبان في المنظفات.

ثم, إضافة ملليلتر واحد من المخزن المؤقت الملح العالي مع مثبطات البروتين. انقله إلى مغالط نظيف ، وقم بإخراج 100 ضربة. انقل المتجانس مرة أخرى إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق وضع الأنبوب على شاكر دوار في الغرفة الباردة لمدة ساعة واحدة.

الطرد المركزي المتجانسات عند 20،000 مرة G في أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة وتخلص من المادة الطافية. أضف ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت PBS EDTA المثلج البارد إلى الحبيبات وانقله إلى الخالط النظيف كخطوة تنظيف نهائية. بعد التجانس ، انقل العينة إلى أنبوب جديد وقم بطردها عند 20،000 مرة جم في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق للحصول على مستخلص الملح الغني بالبروتين IF ، أو HSC.

تخلص من المادة الطافية وقم بإذابة الحبيبات في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة SDS غير المسخن مسبقا. قم بتفتيت الحبيبات في البداية عن طريق سحب العينات والدوامة. ثم سخني العينات عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

دوامة وماصة حسب الحاجة ، لضمان إذابة الحبيبات تماما والتي قد تستغرق عدة دقائق. قم بتخزين جميع العينات على حرارة سالب 20 درجة مئوية حتى التحليل. لإجراء استخراج الحمض النووي الريبي ، أضف عازلة التحلل في أنبوب يحتوي على مصفوفة اللايسين D ، ثم أضف عينة الأنسجة إلى محلل الأنسجة وانبض مرتين لمدة 25 ثانية لكل منهما.

افصل المحللة عن المصفوفة عن طريق الطرد المركزي عند 20 ، 000 مرة G.لاستخراج البروتين ، أضف المخزن المؤقت للعينة Triton X-100 أو SDS في حالة تحضير المحللة الكاملة. في أنبوب ليسين مع مصفوفة ليسين SS. ثم أضف عينة الأنسجة اخفقي العينة لفترة وجيزة للخلط.

لتحضير HSC ، استخدم مغناطيسا لإزالة حبة الفولاذ المقاوم للصدأ من الأنبوب ، وقم بالطرد المركزي للأنابيب عند 20 ، 000 مرة جم في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. افصل بين الكسور الطافية والحبيبات واستمر كما هو موضح سابقا في الفيديو. قم بإعداد المخزن المؤقت PBST عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من T20 إلى 50 مل من PBS pH 7.4.

ثم قم بإعداد محلول الأجسام المضادة PTM عن طريق إضافة واحد إلى 10 ميكروغرام من الجسم المضاد إلى 200 ميكرولتر من PBST. Aliquot 50 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي في أنبوب الطرد المركزي الصغير. ضعه على المغناطيس ، واستنشق محلول تخزين الخرز.

اقتران الخرزات بالجسم المضاد للترسيب المناعي عن طريق تعليق الخرزات في محلول الجسم المضاد واحتضان العينة على دوار في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. ضع الأنابيب على المغناطيس ، واستنشق محلول الجسم المضاد. ثم استخدم 200 ميكرولتر من PBST لشطف الخرز المترافق بالأجسام المضادة مرة واحدة ، وإزالة المحلول.

أضف 0.6 إلى مليلتر واحد من محللة الأنسجة إلى الخرز. امزج عن طريق سحب العينة برفق ، واحتضن المحلول على دوار في غرفة باردة لمدة ثلاث ساعات. ضع الأنابيب على المغناطيس وقم بإزالة المحللة ، ثم استخدم 200 ميكرولتر من PBST لغسل الخرزات خمس مرات.

بعد خطوة الغسيل الأخيرة ، اجمع الخرز و 100 ميكرولتر من PBS وانقل الخرزات إلى أنبوب جديد نظيف. ضع الأنبوب على المغناطيس ، ثم استنشق PBS. قم بإزالة الأنبوب من المغناطيس وأضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة غير المختزل.

Aliquot 50 ميكرولتر من الأنبوب ، واجمعها مع 5٪ 2ME لعمل عينات مختزلة. سخني العينات إلى 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. باستخدام الأنبوب الموجود على المغناطيس ، اجمع جزء IP من الخرز ، وانقله إلى أنبوب جديد.

قم بتخزين العينات على حرارة سالب 20 درجة مئوية حتى التحليل. لتجنب تلوث عينات البروتين لتحليل قياس الطيف الكتلي ، استخدم قفازات نظيفة للتعامل مع جميع المواد الهلامية واحتضانها في حاويات نظيفة تم غسلها فقط باستخدام DD H2O. قم بتشغيل 20 إلى 50 ميكرولترا من عينة HSE على جل صفحة SDS وفقا للشروط القياسية.

بعد تلطيخ الجل وفقا لبروتوكول النص ، ضع الجل بين واقيات الألواح البلاستيكية. ثم امسح وقم بتمييز العصابات التي سيتم استئصالها. استخدم ماكينة حلاقة جديدة ونظيفة لاستئصال أشرطة بروتين IF ووضع العصابات في أنابيب نظيفة لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة على الجليد قبل تقديمها لتحليل قياس الطيف الكتلي.

يوضح هذا الشكل نتيجة نموذجية ل HSEs من تسعة أنسجة فئران معزولة باستخدام الطريقة السريعة. لاحظ أن هذه الطريقة لا تعمل بشكل جيد على البنكرياس والطحال ، وتنتج عصابات إضافية في عينة الأمعاء الغليظة. يظهر تحليل التعبير الجيني هذا الكيراتين 8 يتم تنظيمه أثناء الشيخوخة.

بالإضافة إلى ذلك ، تظهر اللطحات الغربية أن الكيراتين 8 ينظم بقوة في كبد الفئران القديمة. هنا ، يوضح HSE للكبد الذي تم الحصول عليه باستخدام البروتوكول الآلي الإثراء القوي للكيراتين 8 و 18 على الجل. يظهر تحليل قياس الطيف الكتلي أن K8 و K18 في الكبد من فأر قديم لهما مواقع متعددة للفسفرة والأستيل غير موجودة في الكبد من الفأر الصغير.

على غرار تغيرات الكيراتين في الكبد ، يكشف تحليل أنسجة المخ بواسطة QPCR عن تحريض خمسة أضعاف ل GFAP mRNA في أدمغة 24 شهرا مقارنة بالفئران البالغة من العمر ثلاثة أشهر. أخيرا ، يكشف تحليل البروتين لمستخلصات الملح العالية بواسطة صبغة Coomassie ، والبقع المناعية للأجزاء الكلية والأسيتيل ليسين المخصب أن بروتين GFAP يتم تنظيمه وأسيتيله في دماغ الفأر المسن. باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق أخرى مثل مزيج البروتيو القائم على قياس الطيف الكتلي للإجابة على أسئلة إضافية مثل ما هي التعديلات اللاحقة الانتقالية المهمة وشركاء الربط لبروتينات الخيوط الوسيطة خلال الظروف الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية المختلفة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل بروتينات الخيوط الوسيطة من أنسجة الثدييات المختلفة.