استخدام Caenorhabditis elegans كنظام نموذجي لدراسة توازن البروتين في كائن حي متعدد الخلايا

الهدف العام من التجارب التالية في أناقة CENO R القابلة للتتبع وراثيا هو مراقبة البروتين الخاطئ على ثلاثة مستويات ، الكائن الحي والخلايا والبروتينات. تعمل الأنماط الظاهرية السلوكية مثل الحركة أو المقاومة الحرارية كقراءات للتغيرات في توازن البروتين على مستوى الكائن الحي ، أو حساسة لدرجة الحرارة ، أو تحدث بشكل طبيعي. تستخدم البروتينات المستقرة لمتابعة توطين البروتين الخاطئ ، والذي يمكن أن يرتبط بسوء طي البروتين.

يراقب اختبار الهضم الجزئي خارج الجسم الحي استقرار البروتين مباشرة. يمكن أن تظهر النتائج تغيرات في قدرة البروتين في درجات حرارة الزراعة المختلفة بناء على مقايسة المقاومة الحرارية ، والفحص المجهري المناعي ، وتحليل الدم الغربي. سيتم عرض هذه الإجراءات من قبل طلاب الدراسات العليا في مختبري.

سيتم عرض الفحص السلوكي بواسطة ish ido وسيوضح Shai التلوين المناعي وسيظهر ANA flunking و sheron الهضم الجزئي. يرافق هذا البروتوكول لقياس تحمل درجة الحرارة خطوات تحضيرية لمزامنة ومقايسة الحركة. كلاهما موصوف في بروتوكول النص يبدأ بجمع النسخ المتماثلة التي تحتوي على 20 متزامنا على الأقل.

في 24 ، الآبار التي تم لعبها بشكل جيد تحتوي على 450 ميكرولتر من عازلة الصدمات الحرارية. استكمل كل بئر بتسعة ميكرولترات من السيتوكسين. الآن انقل اللوحة إلى حمام ساخن.

تعتمد الصدمة الحرارية ودرجة الحرارة والمدة بشدة على ظروف النمو. على وجه الخصوص ، تسجل درجة حرارة الزراعة بقاء على قيد الحياة من خلال مراقبة امتصاص الموت. باستخدام مجسم الفلورسنت مع مرشح TXR ، ماتت التي تأخذ النرد.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية للطرق الحالية مثل kine ، التسامح عن طريق التسجيل اليدوي هو استخدام القراءة المرئية لوفيات ، مما يجعل هذا المقال أسرع بكثير وأكثر قابلية للتكرار. في المرحلة المطلوبة ، انقل ما لا يقل عن 30 إلى أنبوب طرد مركزي صغير يحتوي على المخزن المؤقت M تسعة. اغسل عدة مرات باستخدام M تسعة عن طريق أداء خطوات طرد مركزي قصيرة ومنخفضة السرعة وتعليقها في M تسعة.

ثم ضع الأنابيب على الثلج لبضع دقائق حتى تبرد. بمجرد أن يبرد ، قم بإزالة السائل الزائد واحتضان الأنابيب. في 500 ميكرولتر من البرد الجليدي ، 4٪ ألدهيد بارافورم.

يجب معايرة وقت الحضانة لكل بروتين يتم فحصه ويجب أن يكون حوالي خمس إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الآن ، اغسل الثابتة ثلاث مرات باستخدام PBS tween عند درجة الحموضة 7.2 عن طريق الطرد المركزي. يتم إجراء أجهزة الطرد المركزي دائما عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة أو دقيقتين ما لم ينص على خلاف ذلك.

في الغطاء ، قم بإزالة معظم المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من محلول ميركابتو إيثانول شعاعي. ثم احتضان عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع هزاز لطيف في اليوم التالي في غطاء المحرك. اغسل ثلاث مرات باستخدام PBST عن طريق الطرد المركزي و Resus.

قم بإنهاء الغسيل ب 50 إلى 100 ميكرولتر من PBST وقم بإزالة معظم PBST بعد طرد مركزي آخر. بعد ذلك ، أضف 100 إلى 150 ميكرولتر من محلول الكولاجيناز واحتضان عند 37 درجة مئوية مع تحريض قوي. استخدم خلاطا حراريا أو حاضنة رج.

بعد خمس دقائق ، ابدأ في إجراء فحوصات دورية تحت مجهر استريو. عندما يتم كسر خمس ، أوقف التفاعل عن طريق وضع الأنبوب على الجليد. هذه الخطوة حساسة للغاية.

تعتمد مدة العلاج على ظروف التثبيت ، ويمكن أن تتغير بشكل كبير بين السلالات. يمكن أن تؤدي الحضانة المطولة إلى تدهور كامل للحيوانات. يجب معايرة الظروف قبل كل دفعة إنزيم ويجب مراقبة التحلل بعناية.

بعد ذلك ، اغسل مرتين في PBST. اجمع عن طريق الطرد المركزي وقم بإزالة معظم PBST. ثم أضف ملليلترا واحدا من محلول BA متبوعا بالحضانة مع هزاز لطيف لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة ، واجمع عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليقها في 200 ميكرولتر من b ، A. أضف الآن الجسم المضاد الأساسي وابدأ الحضانة بين عشية وضحانة مع هزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة.

تحتاج هذه المعلمات إلى معايرة. بعد ذلك ، اغسل عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليقها في مليلتر من ب ، أ واحتضانها بخلط لطيف لمدة 15 دقيقة إلى ساعة في درجة حرارة الغرفة.

في هذه المرحلة ، يمكن إضافة إضافة اختيارية لصبغة الفلورسنت. بعد ذلك ، كرر غسل المخزن المؤقت BA ثلاث مرات أخرى وقم بإنهاء الغسيل عن طريق تعليق Resus في 100 ميكرولتر من BA مع الجسم المضاد الثانوي المناسب الموسوم بالفلورسنت عند تخفيف واحد إلى 100. احتضان العينات بالهزاز لعدة ساعات في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء لمسح الثانوية.

قم بإجراء ثلاث غسلات باستخدام أ ، ب ، أ. ثم قم بتركيب على الشرائح بواسطة Resus أولا ، وتعليقها في 10 ميكرولتر من b ، a ، ثم استخدام ماصة ذات تجويف عريض لنقل ميكرولتر أو اثنين من العينة إلى كل شريحة ، أضف حجما متساويا من وسيط التثبيت وقم بتغطية الشريحة. أغلق الشريحة برفق بطلاء الأظافر.

يمكن تخزين الشرائح عند سالب 20 درجة مئوية لفترات طويلة. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذا البروتوكول لأن البروتوكول طويل ويتضمن العديد من الخطوات التي يمكن أن تؤثر على كفاءته مما يجعل استكشاف الأخطاء وإصلاحها أمرا صعبا. ابدأ بجمع من حوالي 1560 ملم في واحد أو ملليلتر من M تسعة.

لا ينبغي أن تكون مكتظة. اغسل عدة مرات باستخدام M nine buffer عن طريق الطرد المركزي وتعليق. بعد الدوران النهائي ، يعلق الإعادة في 100 ميكرولتر من M تسعة.

ثم قم بتجميد وباستخدام مدقة مبردة وحفر ، قم بطحن العينة أثناء وجودها على الجليد. كثيرا ما يتم إيقافها مؤقتا للتحقق مما إذا كانت مطحونة بدرجة كافية. بمجرد سحق بالكامل ، قم بتقدير حجم مستخلص الديدان.

ثم أضف حجما متساويا من محلول تحلل الدودة x واحتضان العينة على الجليد لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإزالة الحطام عن طريق دورة الطرد المركزي المبردة ونقل المادة الطافية إلى أنبوب نظيف من الطرد الدقيق. بعد اختبار برادفورد ، قم بتخفيف العينة إلى ثلاثة إلى 3.5 ملليغرام من البروتين لكل مليلتر.

ثم يضاف محلول التربسين الكامو المبرد الطازج بنسبة واحد إلى 1200. في هذه المرحلة ، اضبط العينة على الحضانة لمدة ساعة. أثناء الحضانة ، خذ بشكل دوري 20 ميكرولتر من الحصص واخلطها على الفور مع المخزن المؤقت SDS ، تليها خمس دقائق عند 96 درجة مئوية.

قم بتشغيل العينات واتبعها بتحليل الدم الغربي لتحديد الاستقرار النسبي للبروتين. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر عدم إضافة كوكتيل مثبط الإنزيم البروتيني إلى عينة الهضم وبدلا من ذلك سنحتفظ بسرعة بالعينات على الجليد. تؤثر طفرة E 781 K ts في مرافق العضلات في 45 بشدة على طي الميوسين وتجميعه وبالتالي تؤثر على حركة.

عندما نمت هذه الطفرات في درجات حرارة أعلى من 20 درجة مئوية ، كانت مشلولة تماما ، ولكن ليس عند 15 درجة مئوية. عندما تعرضت البرية التي تربى عند 25 درجة مئوية لصدمة حرارية طويلة الأمد ، نجا معظمها. في حين أن 30٪ فقط نجوا إذا تم رفعهم عند 15 إلى 20 درجة مئوية لمراقبة المعدلات الفعالة على استجابة الصدمة الحرارية ، فقد ارتفعت ظروف إجهاد التحكم إلى معدل بقاء 70٪ للحيوانات البرية.

تعرضت لصدمة حرارية بزاوية 37 درجة مئوية لمدة ست ساعات. في اليوم الأول من مرحلة البلوغ ، تم فحص البقاء على قيد الحياة من خلال مقايسة امتصاص البرتقال cyt. يشار إلى النافقة بالسهام البيضاء الحية بالسهام الصفراء.

تم تصور توطين العديد من البروتينات المستقرة باستخدام أجسام مضادة محددة. على سبيل المثال ، يتم توطين البارامين في التجميعات متعددة الكريستالات بدلا من العضلات الكونكورميرية في ظل ظروف مقيدة. وبالمثل ، فإن الميوسين TS يشكل خيوطا غير منظمة بدلا من الهياكل الخيطية عالية الترتيب عند درجة الحرارة المقيدة.

التي تعبر عن العديد من البروتينات الطافرة TS التي يتم التعبير عنها بشكل مشترك مع myo ثلاثة. أظهر GFP تدهورا سريعا في تنظيم خيوط العضلات كما تم اكتشافه من خلال مراقبة تغيرات GFP في تأكيد الميوسين يمكن أن يعكس التغيرات في قدرة طي خلايا العضلات. يظهر نمط تجزئة الانحلال للبروتين لسلسلة الميوسين الثقيلة ، وهو تعبير مشترك مع UNC 45 Ts خصائص مميزة مقارنة بملف تعريف الهضم للميوسين من البرية التي تدعم الادعاء بأن طي الميوسين يتأثر ب UNC 45.

فقدان الوظيفة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتنظيم البروتين في أناقة البحر ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا في أنظمة أخرى مثل الكائنات الحية النموذجية المختلفة.