بروتوكول محسن لاستخراج البروتينات من صمام ميترال الإنسان

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخلاص البروتينات بكفاءة من الصمام المترالي للقلب البشري، بحيث تكون مناسبة للتحليل البروتومي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الكشف عن الآليات المسببة للأمراض في مجال أمراض صمامات القلب، مما يسمح بتحديد علامات تشخيصية وإنذارية جديدة للمرض، وآمال في الوصول إلى أهداف علاجية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول في أنه يوفر سير عمل فعال للاستخلاص يتوافق مع العديد من التطبيقات التحليلية.

تتمثل النتائج في تقديم توصيف أكثر شمولاً لبروتوم الصمام المترالي القلبي. علاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذا البروتوكول أيضاً على أنظمة أخرى، مثل الصمام المترالي للخنزير، الذي يتشابه بشكل وثيق مع الصمام البشري ويُستخدم في النماذج التجريبية لتقييمات وظائف الصمامات. ستقوم ستيفانيا غيلاردي، وهي فنية من مختبري، بشرح الإجراء التجريبي.

لتحضير الصمام التاجي البشري، ابدأ بقلب مستأصل خضع لنقص تروية بارد لمدة تتراوح من 4 إلى 12 ساعة. في غرفة نظيفة، أخرج القلب من حقيبة النقل وضعه في دلو معقم. بعد ذلك، انقل القلب إلى كابينة السلامة البيولوجية.

هناك، وباستخدام مشرط طبي يمكن التخلص منه، قم بالقطع بشكل عمودي على المحور الرئيسي عند مستوى البطينين الأيسر والأيمن، على بُعد حوالي أربعة سنتيمترات من القمة. ثم ضع القلب فوق غطاء معقم. بعد ذلك، أزِح الأبهر الصاعد والشريان الرئوي جانباً للوصول إلى سقف الأذين الأيسر.

على سقف الأذين الأيسر، استخدم الملاقط والمناقير للقص حول الأذينة اليسرى للكشف عن الصمام المترالي. يقع الصمام المترالي بالكامل داخل البطين الأيسر؛ لذا، قم بالكشف عن الوريقة المترالية الكبيرة والوريقة المترالية الصغيرة.

تحدد الصليتان الأمامية الجانبية والخلفية الإنسية حدود المنطقة الأمامية والخلفية. الآن، وباستخدام مقص وملاقط غير صدمية، قم بتشريح الأذين الأيسر وسماكة جدار البطين المحيط بالصمام الميترالي. وخلال هذا التشريح، حدد استمرارية الصمام الميترالي الأبهري.

بعد ذلك، افصل وريقة الصمام المترالي الأمامية عن وريقة الصمام المترالي الخلفية عن طريق القص على طول الصمامين اللذين يحدان الوريقة الخلفية. عند الانتهاء من الإجراء، قم بتطهير طاولة الكابينة باستخدام محلول isopropyl alcohol بتركيز 70% ومحلول hydrogen peroxide بتركيز 6%. الآن، اغسل الوريقة الخلفية للصمام المترالي في محلول ملحي.

بعد ذلك، قطع الصمام إلى قطع صغيرة، بحيث تكون كل قطعة أقل من سنتيمتر مربع واحد. غلف القطع بشكل فردي بورق الألومنيوم، ثم قم بتجميدها سريعاً باستخدام النيتروجين السائل. لبدء عملية استخلاص البروتين، استخدم الملقط لإزالة عينة من النيتروجين السائل، وضعها فوراً على الثلج الجاف.

لا تسمح للعينة بالذوبان. بعد ذلك، ضع الهاون والمدقات الملحقة به والعينة داخل قارورة ديوار مملوءة بالنيتروجين السائل. من الضروري استخدام النيتروجين السائل لتجميد العينة وتبريد نظام الطحن.

تمنع هذه الخطوة التحلل البيولوجي وتسمح بعملية سحق فعالة، ولكنها تتطلب تدريباً تقنياً للتعامل الآمن. بمجرد التجميد السريع، ضع الهاون والمدقات في صندوق من البوليسترين يحتوي على ثلج جاف. ضع أيضاً ملعقة مسطحة على الثلج الجاف.

بعد ذلك، قم بإزالة العينة من رقاقة القصدير ووضعها في الهاون. ثم ضع المدقة الأكبر فوقها. وباستخدام مفك براغي لتدوير المدقة، اطحن العينة من 15 إلى 20 مرة.

أثناء الطحن، اخلط العينة باستخدام طرف ملعقة مختبرية مبردة. وبعد استخدام المدقة الكبيرة، كرر عملية الطحن باستخدام مدقة أصغر. يعد الحصول على مسحوق ناعم أمراً بالغ الأهمية لاستخلاص البروتين بكفاءة.

الآن، قم بتفريغ العينة المسحوقة في أنبوب طرد مركزي سعة 15 millileter معلوم الكتلة. بعد ذلك، استخدم ملعقة مسطحة باردة لجمع أي مواد متبقية ونقلها إلى الهاون. احتفظ بالأنبوب الذي يحتوي على العينة فوق الثلج الجاف وقم بتحديد كتلة العينة بسرعة.

بعد ذلك، صب العينة في أنبوب تجانس زجاجي. ثم أضف 200 µL من منظم اليوريا لكل 10 mg من العينة. وأثناء القيام بذلك، استعد الرواسب المتبقية في الأنبوب عن طريق شطفها باستخدام حصة منظم اليوريا.

الآن، قم بتجانس العينة باستخدام مدقة PFTE آلية تعمل بسرعة 1, 500 rpm. اضغط بالمدقة ببطء على العينة مع تدويرها 10 مرات. بعد ذلك، انقل الطافي الأصفر اللزج إلى أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 1.7 milliliter باستخدام ماصة زجاجية.

كرر الآن عملية التجانس على العينة المتبقية باستخدام نصف كمية الـ urea. استعد الطبقة الطافية واجمعها مع المجموعة السابقة. بعد ذلك، ضع الأنبوب على جهاز تدوير الأنابيب لمدة 30 دقيقة.

بعد مرور 30 دقيقة، ضع الأنبوب في جهاز طرد مركزي مبرد وقم بتدوير العينة عند 13,000 G لمدة نصف ساعة. بعد ذلك، استعد السائل الطافي، وقم بقياس تركيز البروتين باستخدام مقايسة برادفورد للبروتين.

بعد تنفيذ البروتوكول المحدد، تمت دراسة مستخلص البروتين باستخدام مجموعة متنوعة من الطرق بعد إجراء بعض المعالجات الإضافية. تم تحديد إجمالي 422 بروتيناً في نسيج الصمام المترالي عن طريق الفصل الكهربائي ثنائي الأبعاد، والتركيز المتساوي الكهربي في الطور السائل، والكروماتوغرافيا السائلة المقترنة بمطياف الكتلة، والكروماتوغرافيا السائلة ثنائية الأبعاد المقترنة بمطياف الكتلة. تم تصنيف الـ 422 بروتيناً باستخدام تحليل الوجود الجيني (Gene Ontology).

احتوت المناطق خارج الخلوية على عدة بروتينات متوقعة وبروتينات أخرى داخل خلوية وبروتينات سطح الخلية. وقد تم تحديد العديد منها لأول مرة في الصمامات التاجية. كما تم تأكيد وجود أربعة من هذه البروتينات التي لم يتم تحديدها مسبقاً في الصمامات التاجية باستخدام أجسام مضادة في ثلاث عينات فريدة.

البروتينات هي Septin-11، وFour and a half LIM domains protein one، وDermatoponin، وalpha crystalline B. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخلاص البروتينات من الصمام التاجي في القلب من أجل تحديد هويتها وقياس كميتها. وبمجرد إتقان هذا البروتوكول، يمكن إتمامه في غضون ساعتين تقريبًا إذا نُفذ بشكل صحيح. وأثناء محاولة إجراء هذه العملية، وللحصول على أكبر عائد من البروتينات مع الحفاظ على سلامتها العالية، من الضروري ألا تذوب العينات أثناء أي من عمليات النقل.