دمج استخراج الصلبة المرحلة المصغرة و لك-مس / مس الكشف عن 3-نيتروتيروسين في البول البشري للتطبيقات السريرية
يوليو 14, 2017
تم تطوير طريقة قياس الطيف الكتلي السائل الانتقائي والحساسي جنبا إلى جنب مع استخراج الطور الصلب الفعال على صفيحة ميكروبلات (مسكس) 96-جيدا ميكروبلات (مسكس) لقياس 3-نيتروتيروسين مجانا ( 3-نت) في البول البشري مع الإنتاجية العالية، والتي هي مناسبة للتطبيقات السريرية.
الهدف العام من هذا الاستخراج الصلبة المصغر جنبا إلى جنب مع اختبار LC-MS / MS هو تحديد 3-نيتروتيروزين الحر بدقة في بول الإنسان للتطبيقات السريرية. يساعد 3-نيتروتيروزين الحر في الغلة ومؤشر حيوي للإجهاد التأكسدي. ومع ذلك ، سيظل تحديا خاصا لتحديد كمية 3-نيتروتيروزين بدقة في حالات الطوارئ البيولوجية للتطبيقات السريرية بسبب عدم كفاية الحساسية والانتقائية واستعدادات العينات المرهقة.
تسمح هذه التقنية التي تتضمن استخراج الطور الصلب الفعال في تفاعل LC-MS / MS شديد الحساسية تحديدا سريعا ومحددا ودقيقا للمستويات المنخفضة من 3-nitrotyrosine الذاتية في بول الإنسان دون الحاجة إلى التكوين و LC ثنائي الأبعاد.على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للتحقيق في الإجهاد التأكسدي ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الحالات المرضية الأخرى مثل الاضطرابات الالتهابية والتنكسية العصبية المعقدة. يمكن توسيع الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو مراقبة فعالية العلاج المضاد للأكسدة لأنه يمكن تقليل مستوى 3-نيتروتيروزين عن طريق مضادات الأكسدة. لبدء هذا الإجراء ، أعدت الدوامة مسبقا وأذابت عينات البول والمعايير وعينات مراقبة الجودة.
بعد الدوامة ، أضف 250 ميكرولترا من كل عينة وقياسيا إلى 32 بئرا من لوحة تجميع نظيفة سعة ملليلترين سعة 96 بئر. أضف 50 ميكرولترا من محلول العمل القياسي الداخلي المعد مسبقا إلى كل بئر باستثناء العينة الفارغة المزدوجة. ثم أضف 50 ميكرولترا من الماء من الدرجة LC-MS مع 0.01٪ من حمض الفورميك إلى بئر العينة الفارغة المزدوجة.
بعد ذلك ، أضف 250 ميكرولترا من الماء من الدرجة LC-MS مع 0.1٪ من حمض الفورميك إلى الآبار. ثم امزج المحاليل ثلاث مرات باستخدام ماصة ثماني قنوات وقم بتغطية اللوحة حتى تحميل SPE. بعد ذلك ، ضع صفيحة دقيقة لاستخراج 96 بئر لتبادل الكاتيون المختلط وخزان تجميع على معالج الضغط الإيجابي.
يتيح استخراج الطور الصلب باستخدام صفيحة دقيقة للتبادل الكاتيوني في الوضع المختلط تنظيف العينة في وقت واحد وإثراء 3-نيتروتيروزين في استخراج واحد. قم بتكييف لوحة الاستخراج عن طريق تدفق 200 ميكرولتر من الميثانول من الدرجة LC-MS عبر المادة الماصة. أدر مقبض ضبط الضغط على معالج الضغط الإيجابي لضبط ضغط إيجابي منخفض للسماح للخليط بالتدفق عبر المادة الماصة ببطء ، وضبط الضغط إذا لزم الأمر.
التوازن عن طريق تدفق 200 ميكرولتر من الماء من الدرجة LC-MS مع حمض الفورميك بنسبة 2٪ من خلال المادة الماصة. باستخدام ماصة ثماني القنوات، قم بتحميل الحجم الكامل لكل عينة من العينات المخلوطة مسبقا بعناية على لوحة الاستخراج المكيفة مسبقا. اضبط ضغطا إيجابيا منخفضا على معالج الضغط الإيجابي للسماح للخليط بالتدفق عبر المادة الماصة ببطء ، مع ضبط الضغط حسب الحاجة.
بعد ذلك ، اغسل الآبار عن طريق تدفق 200 ميكرولتر من المياه من الدرجة LC-MS مع حمض الفورميك بنسبة 2٪ من خلال المادة الماصة. بعد الغسيل ب 200 ميكرولتر من الميثانول والماء ، اضبط معالج الضغط الإيجابي على ضغط عال لتجفيف الآبار. بمجرد أن تجف الآبار ، استبدل الخزان بلوحة تجميع نظيفة سعة ملليلتر سعة 96 بئرا.
الآن ، ضع 50 ميكرولترا من محلول أسيتات الأمونيوم 25 ملليمولار لتخلص التحليل المحتفظ به ببطء والمعيار الداخلي من لوحة الاستخراج. ثم أضف 50 ميكرولترا من الماء من الدرجة LC-MS مع حمض الفورميك بنسبة 5٪ لتحييد مادة المواد. يوفر تطبيق محلول أسيتات الأمونيوم الخفيف لشطف 3-نيتروتيروزين انتقائية وحساسية معززة بشكل كبير.
امزج العينات بماصة ثماني القنوات ثلاث مرات استعدادا لتحليل قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة. بعد إعداد أداة LC-MS / MS ، قم بموازنة طريقة 3-nitrotyrosine LC-MS / MS لمدة 10 دقائق باستخدام شطف التدرج LC. من خلال موازنة الطريقة ، سيتم موازنة تدرج LC مع شطف التدرج الأولي.
سيتم ضبط درجة حرارة جهاز أخذ العينات التلقائي على أربع درجات مئوية وسيتم ضبط درجة حرارة الفرن على 30 درجة مئوية. قم بإنشاء قائمة دفعية تتضمن عينات البول والمعايير وعينات مراقبة الجودة. ثم ابدأ الدفعة عن طريق حقن العينات المعدة.
بعد الانتهاء من جميع الحقن, إنشاء منحنى قياسي مع مجموعة من 10 إلى 2, 500 بيكوغرام لكل مليلتر لكمية 3-نيتروتيروزين عن طريق الانحدار الخطي لنسبة مساحة الذروة من 3-نيتروتيروزين والمعيار الداخلي مقابل التركيز الاسمي 3-نيتروتيروزين. أخيرا ، حدد جميع العينات الأخرى باستخدام المنحنى القياسي المحدد وحدد ما إذا كانت عينات مراقبة الجودة تقع ضمن النطاق المحدد. تظهر بيانات LC لعينات البول البشرية أن 3-نيتروتيروزين يتم فصله كروماتوغرافيا عن نظائر التيروزين الأخرى المتشابهة هيكليا في ظل الحالة المثلى التي تقضي على التداخلات المشتركة بسبب هذه المركبات المفرطة إلى حد كبير وبالتالي تعزز درجة انتقائية الفحص.
لا يتم ملاحظة إشارة 3-نيتروتيروزين في الرسم الكروماتوغرامي لمراقبة التفاعل المتعدد للعينة الفارغة المزدوجة ، مما يشير إلى أن 3-نيتروتيروزين لا يتشكل خلال العملية برمتها. يتم عرض الكروماتوغرامات التمثيلية لمراقبة التفاعل المتعدد من 3-نيتروتيروزين والمعيار الداخلي للفرد السليم هنا. لم يلاحظ أي إشارات متداخلة في أوقات الاحتفاظ ب 3-nitrotyrosine والمعيار الداخلي.
يظهرهنا منحنى قياسي تمثيلي. تم تحديد حد الكشف المعرف بأنه أدنى تركيز مع نسبة إشارة إلى ضوضاء أكبر من ثلاثة ليكون بيكوغرامين لكل مليلتر. تم تحديد الحد الأدنى للقياس الكمي على أنه 10 بيكوغرام لكل مليلتر ويتم تعريفه على أنه أدنى تركيز في حدود 20٪ من عدم الدقة والدقة مع نسبة إشارة إلى ضوضاء أكبر من 10.
يوفر اختبار التكامل المضبوط بدقة تحسنا كبيرا في الخصوصية والحساسية والإنتاجية مع تقليل تأثير المصفوفة واستخدام المواد الماصة والتخلص من النفايات. باستخدام هذا الفحص البسيط والسريع ، يمكن معالجة عينة البول في غضون 24 ساعة. ضع في اعتبارك أخذ عينات البول غير الغازية وغير المكلفة.
هذه الطريقة المحسنة بشكل ملحوظ مناسبة تماما لتقييم دور 3-نيتروتيروزين كمؤشر حيوي للإجهاد التأكسدي في الدراسات قبل السريرية والسريرية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة حساسة للغاية لكروماتوغرافيا السائل المقترنة بالتحليل الطيفي الكتلي (LC-MS/MS) لتحديد الكمية الحرة من 3-نيتروتيرोसين في بول الإنسان. تتضمن الطريقة استخراج المرحلة الصلبة، مما يجعلها مناسبة للتطبيقات السريرية والتحقيقات في الإجهاد التأكسدي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- الكيمياء الحيوية السريرية
- أبحاث الإجهاد التأكسدي
الخلفية
- 3-نيتروتيروسين الحر هو علامة حيوية للإجهاد التأكسدي.
- التحديد الدقيق في العينات البيولوجية صعب بسبب مشاكل الحساسية والانتقائية.
- الطرق الحالية غالبًا ما تتضمن تحضيرات عينات معقدة.
- الإجهاد التأكسدي مرتبط بظروف مرضية مختلفة، بما في ذلك الاضطرابات التنكسية العصبية.
غرض الدراسة
- تطوير طريقة لتحديد الكمية الدقيقة لـ 3-نيتروتيروسين الحر في بول الإنسان.
- تسهيل التطبيقات السريرية والبحوث حول الإجهاد التأكسدي.
- تمكين مراقبة فعالية العلاج المضاد للأكسدة.
الطرق المستخدمة
- استخراج المرحلة الصلبة المصغر.
- كروماتوغرافيا السائل المقترنة بالتحليل الطيفي الكتلي (LC-MS/MS).
- تحليل عالي الإنتاجية لعينات البول.
- إعداد المعايير وعينات التحكم في الجودة.
النتائج الرئيسية
- تسمح الطريقة بتحديد سريع ومحدد لمستويات منخفضة من 3-نيتروتيروسين.
- تحسن الحساسية والانتقائية مقارنة بالطرق التقليدية.
- يمكن أن توفر النتائج رؤى حول الإجهاد التأكسدي والحالات المرتبطة به.
- تطبيقات محتملة في مراقبة علاجات مضادات الأكسدة.
الاستنتاجات
- طريقة LC-MS/MS المتقدمة فعالة للتطبيقات السريرية.
- تعالج التحديات في تحديد الكمية لـ 3-نيتروتيروسين في العينات البيولوجية.
- يمكن لهذه التقنية تعزيز البحوث في الإجهاد التأكسدي وآثاره.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of low-abundance biomarkers like 3-nitrotyrosine in human urine is critical for oxidative stress research and clinical biomarker validation. This miniaturized SPE-LC/MS/MS method delivers enhanced sensitivity and selectivity, enabling reliable detection of endogenous 3-NT levels without derivatization or lengthy sample preparation. The high-throughput format supports preclinical and clinical studies requiring rapid, non-invasive biomarker assessment for go/no-go decisions in antioxidant therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of oxidative stress pathways by providing quantitative 3-NT measurements as a functional biomarker.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity through specific detection of free 3-NT in complex biological matrices.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating 3-NT levels with disease states and antioxidant intervention outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers a standardized, reproducible assay with low matrix effect for consistent compound screening.
- Operational Value: Miniaturized SPE on 96-well plates allows processing of 192 samples in 24 hours, improving workflow efficiency.
- Scalability: Reduced solvent consumption and waste disposal lower operational costs for large-scale biomarker studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase oxidative stress mechanisms to preclinical validation via quantifiable urinary biomarker.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables monitoring of antioxidant treatment effectiveness through measurable reductions in 3-NT levels.
- Disease Relevance: Applicable to inflammatory and neurodegenerative disorders where oxidative stress plays a pathogenic role.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing a robust oxidative stress readout.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by quantifying 3-NT as a downstream effector of reactive nitrogen species.
- Screening: Enables assay readiness with high sensitivity (LLOQ 10 pg/mL) and selectivity for reliable compound evaluation in urine.
- Analytics: Provides quantitative MRM-based readouts with signal-to-noise >10 for accurate concentration determination across a 10–2500 pg/mL range.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through biomarker alignment with oxidative stress pathology and antioxidant response.
- Enterprise Reuse: The miniaturized SPE-LC/MS/MS platform is reusable across multiple studies, reducing revalidation burden.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in oxidative stress biomarker measurement, reduction of false positives from interferences.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and high throughput (192 samples/24h) enable consistent cross-study comparisons.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions in antioxidant development via quantifiable biomarker modulation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on biomarker engagement and mechanism validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in LC-MS/MS method development and solid phase extraction optimization.
- Needs access to positive pressure processors, 96-well SPE plates, and PFP chromatographic columns.
- Demands standardization of sample handling, internal standard use, and MRM transition settings across sites.
- Adaptation to other biological matrices may require reoptimization of elution and cleanup conditions.
- Practical limitation: Method is specific to free 3-NT; total 3-NT measurement would require hydrolysis steps not included here.
