دمج استخراج الصلبة المرحلة المصغرة و لك-مس / مس الكشف عن 3-نيتروتيروسين في البول البشري للتطبيقات السريرية

يتمثل الهدف العام من هذا المقايسة التي تدمج بين الاستخلاص بالطور الصلب المصغر مع تقنية LC-MS/MS في التقدير الكمي الدقيق لـ 3-nitrotyrosine الحر في البول البشري للتطبيقات السريرية. يساعد 3-nitrotyrosine الحر في العائدات ويعتبر مؤشراً حيوياً للإجهاد التأكسدي. ومع ذلك، يظل التقدير الكمي الدقيق لـ 3-nitrotyrosine في الحالات البيولوجية الطارئة للتطبيقات السريرية تحدياً خاصاً بسبب عدم كفاية الحساسية والانتقائية وعمليات تحضير العينات المرهقة.

تسمح هذه التقنية، التي تدمج استخلاصاً فعالاً بالطور الصلب مع نظام LC-MS/MS عالي الحساسية، بالتحديد السريع والنوعي والدقيق للمستويات المنخفضة من 3-nitrotyrosine داخلي المنشأ في البول البشري دون الحاجة إلى تحضير مسبق أو استخدام نظام LC ثنائي الأبعاد. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن تقدم رؤى في أبحاث الإجهاد التأكسدي، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على حالات مرضية أخرى مثل الاضطرابات الالتهابية والعصبية التنكسية المعقدة. ويمكن أن تمتد تطبيقات هذه التقنية لتشمل مراقبة فعالية العلاج بمضادات الأكسدة نظراً لأن مستويات 3-nitrotyrosine يمكن أن تنخفض بفعل مضادات الأكسدة. لبدء هذا الإجراء، قم برج عينات البول التي تم تحضيرها وإذابتها مسبقاً، والمحاليل القياسية، وعينات مراقبة الجودة (QC) باستخدام جهاز vortex.

بعد الرج باستخدام جهاز الفورتكس، أضف 250 µL من كل عينة ومعيار إلى 32 بئراً من لوحة تجميع نظيفة سعة 2 mL تحتوي على 96 بئراً. أضف 50 µL من محلول عمل المعيار الداخلي المُحضّر مسبقاً إلى كل بئر باستثناء بئر عينة الفراغ المزدوج. ثم أضف 50 µL من الماء بدرجة نقاء LC-MS مع 0.01% من حمض الفورميك إلى بئر عينة الفراغ المزدوج.

بعد ذلك، أضف 250 µL من الماء بدرجة LC-MS مع 0.1% من حمض الفورميك إلى الآبار. ثم اخلط المحاليل ثلاث مرات باستخدام ماصة ثمانية القنوات وقم بتغطية اللوحة حتى تحميل SPE. بعد ذلك، ضع لوحة استخلاص دقيقة ذات 96 بئراً للتبادل الكاتيوني ذات الوضع المختلط وخزاناً للتجميع على معالج ضغط إيجابي.

يتيح الاستخلاص بالطور الصلب باستخدام لوحة ميكروية للتبادل الكاتيوني ذات الوضع المختلط تنقية العينة وإثراء 3-nitrotyrosine في وقت واحد خلال عملية استخلاص واحدة. يتم تهيئة لوحة الاستخلاص عن طريق تمرير 200 µL من الميثانول بدرجة LC-MS عبر المادة الماصة. أدر مقبض ضبط الضغط في معالج الضغط الموجب لضبط ضغط موجب منخفض للسماح للمزيج بالتدفق عبر المادة الماصة ببطء، مع ضبط الضغط إذا لزم الأمر.

قم بإجراء عملية الموازنة عن طريق تمرير 200 microliters من الماء بدرجة LC-MS مع 2% formic acid عبر المادة الماصة. وباستخدام ماصة ثمانية القنوات، قم بتحميل الحجم الكامل لكل عينة من العينات المخلوطة مسبقاً بعناية على لوحة الاستخلاص التي تمت تهيئتها. اضبط ضغطاً إيجابياً منخفضاً في معالج الضغط الإيجابي للسماح للمزيج بالتدفق عبر المادة الماصة ببطء، مع تعديل الضغط حسب الحاجة.

بعد ذلك، تُغسل الآبار بتمرير 200 µL من الماء بدرجة LC-MS مع 2% حمض الفورميك عبر المادة المازة. وبعد الغسل بـ 200 µL من الميثانول والماء، يتم ضبط معالج الضغط الإيجابي على الضغط العالي لتجفيف الآبار. وبمجرد جفاف الآبار، استبدل الخزان بلوح تجميع نظيف ذو 96 بئراً بسعة 2 mL.

الآن، يتم وضع 50 µL من محلول خلات الأمونيوم بتركيز 25 mM لشطف المادة التحليلية المحتجزة والمعيار الداخلي ببطء من لوحة الاستخلاص. بعد ذلك، يُضاف 50 µL من الماء بدرجة نقاء LC-MS مع 5% formic acid لمعادلة السائل الشاطف. يوفر استخدام محلول مخفف من خلات الأمونيوم لشطف 3-nitrotyrosine تعزيزاً كبيراً في الانتقائية والحساسية.

امزج العينات باستخدام ماصة ثمانية القنوات ثلاث مرات استعداداً لتحليل مطيافية الكتلة المتوالية المرتبطة بكروماتوغرافيا السوائل. بعد إعداد جهاز LC-MS/MS، قم بموازنة طريقة LC-MS/MS لـ 3-nitrotyrosine لمدة 10 دقائق باستخدام شطف التدرج لكروماتوغرافيا السوائل. ومن خلال موازنة الطريقة، سيتم ضبط تدرج LC على شطف التدرج الأولي.

سيتم ضبط درجة حرارة جهاز السحب الآلي على 4 °C ودرجة حرارة الفرن على 30 °C. قم بإنشاء قائمة بالدفعة تتضمن عينات البول والمعايير وعينات مراقبة الجودة (QC). ثم ابدأ تشغيل الدفعة عن طريق حقن العينات المُحضرة.

بعد الانتهاء من جميع عمليات الحقن، قم بإنشاء منحنى قياسي يتراوح من 10 إلى 2,500 picograms per milliliter لتقدير كمية 3-nitrotyrosine عن طريق الانحدار الخطي لنسبة مساحة القمة لـ 3-nitrotyrosine والمعيار الداخلي مقابل التركيز الاسمي لـ 3-nitrotyrosine. وأخيراً، قم بقياس كمية جميع العينات الأخرى باستخدام المنحنى القياسي الذي تم إنشاؤه، وتحقق مما إذا كانت عينات مراقبة الجودة (QC) تقع ضمن النطاق المحدد. وتظهر بيانات LC لعينات البول البشرية أن 3-nitrotyrosine ينفصل كروماتوغرافياً عن نظائر tyrosine الأخرى المتشابهة هيكلياً في ظل الظروف المثلى، مما يلغي التداخلات الناجمة عن الشطف المشترك بسبب هذه المركبات الموجودة بكميات مفرطة، وبالتالي يعزز درجة انتقائية المقايسة.

لا تظهر إشارة 3-nitrotyrosine في كروماتوغرام المراقبة المتعددة للتفاعلات (multiple reaction monitoring) لعينة الفراغ المزدوج، مما يشير إلى عدم تكون 3-nitrotyrosine خلال العملية بأكملها. تظهر هنا كروماتوغرامات ممثلة للمراقبة المتعددة للتفاعلات لـ 3-nitrotyrosine والمعيار الداخلي لفرد سليم. ولم تُلاحظ أي إشارات تداخل عند أزمنة الاستبقاء لـ 3-nitrotyrosine والمعيار الداخلي.

يظهر هنا منحنى قياسي ممثل. وقد تم تحديد حد الكشف، والمعرف بأنه أدنى تركيز تكون فيه نسبة الإشارة إلى الضوضاء أكبر من ثلاثة، بـ 2 pg/mL. كما تم تحديد الحد الأدنى للتقدير الكمي بـ 10 pg/mL، وهو يُعرف بأنه أدنى تركيز يقع ضمن 20% من عدم الدقة والصحة مع نسبة إشارة إلى ضوضاء تزيد عن 10.

يوفر مقايسة التكامل المُحسَّنة تحسناً ملحوظاً في النوعية والحساسية والإنتاجية، مع تقليل تأثير المصفوفة واستخدام الماصات والتخلص من النفايات. ومن خلال هذه المقايسة البسيطة والسريعة، يمكن معالجة عينة البول في غضون 24 ساعة. مع مراعاة أن أخذ عينات البول عملية غير جراحية وغير مكلفة.

تعد هذه الطريقة المحسنة بشكل ملحوظ مناسبة تماماً لتقييم دور 3-nitrotyrosine كعلامة حيوية للإجهاد التأكسدي في الدراسات قبل السريرية والسريرية.