دمج استخراج الصلبة المرحلة المصغرة و لك-مس / مس الكشف عن 3-نيتروتيروسين في البول البشري للتطبيقات السريرية

الهدف العام من هذا الاستخراج الصلبة المصغر جنبا إلى جنب مع اختبار LC-MS / MS هو تحديد 3-نيتروتيروزين الحر بدقة في بول الإنسان للتطبيقات السريرية. يساعد 3-نيتروتيروزين الحر في الغلة ومؤشر حيوي للإجهاد التأكسدي. ومع ذلك ، سيظل تحديا خاصا لتحديد كمية 3-نيتروتيروزين بدقة في حالات الطوارئ البيولوجية للتطبيقات السريرية بسبب عدم كفاية الحساسية والانتقائية واستعدادات العينات المرهقة.

تسمح هذه التقنية التي تتضمن استخراج الطور الصلب الفعال في تفاعل LC-MS / MS شديد الحساسية تحديدا سريعا ومحددا ودقيقا للمستويات المنخفضة من 3-nitrotyrosine الذاتية في بول الإنسان دون الحاجة إلى التكوين و LC ثنائي الأبعاد.على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للتحقيق في الإجهاد التأكسدي ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الحالات المرضية الأخرى مثل الاضطرابات الالتهابية والتنكسية العصبية المعقدة. يمكن توسيع الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو مراقبة فعالية العلاج المضاد للأكسدة لأنه يمكن تقليل مستوى 3-نيتروتيروزين عن طريق مضادات الأكسدة. لبدء هذا الإجراء ، أعدت الدوامة مسبقا وأذابت عينات البول والمعايير وعينات مراقبة الجودة.

بعد الدوامة ، أضف 250 ميكرولترا من كل عينة وقياسيا إلى 32 بئرا من لوحة تجميع نظيفة سعة ملليلترين سعة 96 بئر. أضف 50 ميكرولترا من محلول العمل القياسي الداخلي المعد مسبقا إلى كل بئر باستثناء العينة الفارغة المزدوجة. ثم أضف 50 ميكرولترا من الماء من الدرجة LC-MS مع 0.01٪ من حمض الفورميك إلى بئر العينة الفارغة المزدوجة.

بعد ذلك ، أضف 250 ميكرولترا من الماء من الدرجة LC-MS مع 0.1٪ من حمض الفورميك إلى الآبار. ثم امزج المحاليل ثلاث مرات باستخدام ماصة ثماني قنوات وقم بتغطية اللوحة حتى تحميل SPE. بعد ذلك ، ضع صفيحة دقيقة لاستخراج 96 بئر لتبادل الكاتيون المختلط وخزان تجميع على معالج الضغط الإيجابي.

يتيح استخراج الطور الصلب باستخدام صفيحة دقيقة للتبادل الكاتيوني في الوضع المختلط تنظيف العينة في وقت واحد وإثراء 3-نيتروتيروزين في استخراج واحد. قم بتكييف لوحة الاستخراج عن طريق تدفق 200 ميكرولتر من الميثانول من الدرجة LC-MS عبر المادة الماصة. أدر مقبض ضبط الضغط على معالج الضغط الإيجابي لضبط ضغط إيجابي منخفض للسماح للخليط بالتدفق عبر المادة الماصة ببطء ، وضبط الضغط إذا لزم الأمر.

التوازن عن طريق تدفق 200 ميكرولتر من الماء من الدرجة LC-MS مع حمض الفورميك بنسبة 2٪ من خلال المادة الماصة. باستخدام ماصة ثماني القنوات، قم بتحميل الحجم الكامل لكل عينة من العينات المخلوطة مسبقا بعناية على لوحة الاستخراج المكيفة مسبقا. اضبط ضغطا إيجابيا منخفضا على معالج الضغط الإيجابي للسماح للخليط بالتدفق عبر المادة الماصة ببطء ، مع ضبط الضغط حسب الحاجة.

بعد ذلك ، اغسل الآبار عن طريق تدفق 200 ميكرولتر من المياه من الدرجة LC-MS مع حمض الفورميك بنسبة 2٪ من خلال المادة الماصة. بعد الغسيل ب 200 ميكرولتر من الميثانول والماء ، اضبط معالج الضغط الإيجابي على ضغط عال لتجفيف الآبار. بمجرد أن تجف الآبار ، استبدل الخزان بلوحة تجميع نظيفة سعة ملليلتر سعة 96 بئرا.

الآن ، ضع 50 ميكرولترا من محلول أسيتات الأمونيوم 25 ملليمولار لتخلص التحليل المحتفظ به ببطء والمعيار الداخلي من لوحة الاستخراج. ثم أضف 50 ميكرولترا من الماء من الدرجة LC-MS مع حمض الفورميك بنسبة 5٪ لتحييد مادة المواد. يوفر تطبيق محلول أسيتات الأمونيوم الخفيف لشطف 3-نيتروتيروزين انتقائية وحساسية معززة بشكل كبير.

امزج العينات بماصة ثماني القنوات ثلاث مرات استعدادا لتحليل قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة. بعد إعداد أداة LC-MS / MS ، قم بموازنة طريقة 3-nitrotyrosine LC-MS / MS لمدة 10 دقائق باستخدام شطف التدرج LC. من خلال موازنة الطريقة ، سيتم موازنة تدرج LC مع شطف التدرج الأولي.

سيتم ضبط درجة حرارة جهاز أخذ العينات التلقائي على أربع درجات مئوية وسيتم ضبط درجة حرارة الفرن على 30 درجة مئوية. قم بإنشاء قائمة دفعية تتضمن عينات البول والمعايير وعينات مراقبة الجودة. ثم ابدأ الدفعة عن طريق حقن العينات المعدة.

بعد الانتهاء من جميع الحقن, إنشاء منحنى قياسي مع مجموعة من 10 إلى 2, 500 بيكوغرام لكل مليلتر لكمية 3-نيتروتيروزين عن طريق الانحدار الخطي لنسبة مساحة الذروة من 3-نيتروتيروزين والمعيار الداخلي مقابل التركيز الاسمي 3-نيتروتيروزين. أخيرا ، حدد جميع العينات الأخرى باستخدام المنحنى القياسي المحدد وحدد ما إذا كانت عينات مراقبة الجودة تقع ضمن النطاق المحدد. تظهر بيانات LC لعينات البول البشرية أن 3-نيتروتيروزين يتم فصله كروماتوغرافيا عن نظائر التيروزين الأخرى المتشابهة هيكليا في ظل الحالة المثلى التي تقضي على التداخلات المشتركة بسبب هذه المركبات المفرطة إلى حد كبير وبالتالي تعزز درجة انتقائية الفحص.

لا يتم ملاحظة إشارة 3-نيتروتيروزين في الرسم الكروماتوغرامي لمراقبة التفاعل المتعدد للعينة الفارغة المزدوجة ، مما يشير إلى أن 3-نيتروتيروزين لا يتشكل خلال العملية برمتها. يتم عرض الكروماتوغرامات التمثيلية لمراقبة التفاعل المتعدد من 3-نيتروتيروزين والمعيار الداخلي للفرد السليم هنا. لم يلاحظ أي إشارات متداخلة في أوقات الاحتفاظ ب 3-nitrotyrosine والمعيار الداخلي.

هنا منحنى قياسي تمثيلي. تم تحديد حد الكشف المعرف بأنه أدنى تركيز مع نسبة إشارة إلى ضوضاء أكبر من ثلاثة ليكون بيكوغرامين لكل مليلتر. تم تحديد الحد الأدنى للقياس الكمي على أنه 10 بيكوغرام لكل مليلتر ويتم تعريفه على أنه أدنى تركيز في حدود 20٪ من عدم الدقة والدقة مع نسبة إشارة إلى ضوضاء أكبر من 10.

يوفر اختبار التكامل المضبوط بدقة تحسنا كبيرا في الخصوصية والحساسية والإنتاجية مع تقليل تأثير المصفوفة واستخدام المواد الماصة والتخلص من النفايات. باستخدام هذا الفحص البسيط والسريع ، يمكن معالجة عينة البول في غضون 24 ساعة. ضع في اعتبارك أخذ عينات البول غير الغازية وغير المكلفة.

هذه الطريقة المحسنة بشكل ملحوظ مناسبة تماما لتقييم دور 3-نيتروتيروزين كمؤشر حيوي للإجهاد التأكسدي في الدراسات قبل السريرية والسريرية.