تعريب كمية البروتين غولجي بالتصوير كتلته مركز الأسفار

الهدف العام من هذه الطريقة القائمة على التصوير هو تحديد موقع بروتين جولجي بدقة نانومتر بشكل كمي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في دراسة جهاز جولجي مثل تنظيم الجولجي وكيفية عمله. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها تستخدم مجهر ضوئي تقليدي وأدوات برمجية.

للبدء، زراعة خلايا HeLa في قارورة T25 في DMEM مع 10٪ FBS وحضانة الزراعة عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون. عندما تصل الخلايا إلى حوالي 80٪ من التلاقط، استنشق وسط الزراعة وأضف ملليلتر واحد من 25٪ تريبسين EDTA إلى القارورة. حضن الخلايا على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين.

أزل الخلايا من الحاضنة وأضف ملليتر واحد من الوسط الكامل لغسل الخلايا بلطف عن جدار القارورة. انقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب طرد مركزي معقم وقم بتدوير الأنبوب بقوة 500 جرام لمدة دقيقتين لدفع الكلمات. بعد استنشاق السوبرناتان، استخدم ملليتر واحد من الوسط الكامل لتعليق حبيبة الخلية.

إزالة الوسط من البئر في صفيحة تحتوي على غطاء زجاجي معقم وزرع حوالي 100,000 خلية في البئر. استخدم الوسط الكامل لزيادة حجم البئر إلى 5 مليليتر. ثم حضن الصفيحة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

عندما تصل الخلايا إلى 80٪ من التلاقط، استخدم 80 نانوجرام من GalT-mCherry و320 نانوجرام من الحمض النووي البلازميدي TPST1-EGFP وكاشف النقل لنقل الخلايا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. بعد حضانة الخلايا لمدة أربع إلى ست ساعات، غير الوسط وأعد الخلايا إلى الحاضنة لمدة 12 ساعة. استنشق الوسط في البئر وأضف 5 ملليلتر من 33 ميكرومولد نوكودازول يحتوي على وسط كامل، ثم حضن الخلايا عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاث ساعات.

بعد تنظيف انزلاقات أغطية الزجاج وفقا لبروتوكول النص، استخدم مرة واحدة PBS يحتوي على 1 ميكروغرام لكل ميكرولتر من BSA لتخفيف حبيبات فلورسنت متعددة الألوان بطول 110 نانومتر 80 طعف. قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة لتوزيع تجمعات الخرز. باستخدام رأس الماصة، انشر 60 ميكرولتر من الخرزات المخففة على غطاء نظيف.

في الظلام، ضع غطاء الغطاء في طبق بقطر 35 ملم وغطه بورق الألمنيوم. جفف غطاء الغطاء في الظلام باستخدام مجفف متصل بمضخة تفريغ. ثم استخدم 50 ميكرولتر من وسط التثبيت لتثبيت غطاء الغطاء على شريحة زجاجية.

الغطاء النظيف بشكل صحيح ضروري لإزالة الحطام الفلوري. لتصوير خرز متعدد الألوان بقنوات خضراء وحمراء وبعيدة، في بداية جلسة التصوير، يمكنك التقاط مجموعات ثلاثية الأبعاد من الصور، مع التقاط ثلاثة أقسام فوق وتحت أفضل مستوى بؤري. احفظ التكديس كملفات TIFF.

لتصوير مكدسات جولجي المصغرة، استخدم TPST1-EGFP وGalT-mCherry المترجمين في شرائح معلمة بالفلورسنت للعثور على خلايا تعبر عن TPST1-EGFP ومستوى منخفض أو متوسط GalT-mCherry. احصل على مجموعات صور ثلاثية الأبعاد كما هو موضح للتو. لتحليل الصور، افتح الصورة J، اختر ملف، صورة، فتح، لفتح مجموعة من صور الخرز تتكون من ثلاثة ملفات TIFF.

اختر Image، Stacks، Z Project، لمتوسط ثلاثة أقسام متتالية حول أفضل قسم تركيز في القناة الحمراء. أدخل رقم قسم الشريحة البداية وشريحة التوقف ومن بين خيارات نوع الإسقاط، اختر متوسط الشدة. ارسم عائدات الإيرادات في الخلفية لا تحتوي على خرزات في الصورة.

ثم في Analysis، وتعيين القياسات، تحقق فقط من القيمة الرمادية المتوسطة والانحراف المعياري أو SD. نفذ تحليل وقياس، للحصول على متوسط شدة الخلفية والانحراف المعياري. اختر العملية، الرياضيات، الطرح، لطرح الصورة ذات القيم المقابلة لمتوسط شدة الخلفية زائد ستة أضعاف الانحراف المعياري. ثم أدخل القيمة المحسوبة التي تتوافق مع هذه القناة.

كرر المتوسط والطرح لمجموعات صور القنوات الخضراء والحمراء البعيدة باستخدام نفس شريحة البداية والإيقاف ونفس العائد على الخلفية. ادمج الصور الثلاث المعالجة باستخدام الصورة، اللون، دمج القنوات، باختيار القناة R كحمراء، القناة G كخضراء، والقناة B كزرقاء. شغل مدير العائد على الاستثمار باختيار Analysis، Tools، ROI Manager.

ارسم عائد استثمار مربع حول خرزات واحدة. ثم أضف العائد على الاستثمار إلى مدير العائد عن الاستثمار بالضغط على T على لوحة المفاتيح. تحت التحليل، قم بتعيين القياسات، وتحقق فقط من مركز الكتلة.

في مدير العائد على الاستثمار، اختر القناة R وانقر على القياس للحصول على إحداثيات X و Y لمراكز العائد على الاستثمار في نافذة النتائج. انسخ والصق العمودين في جدول بيانات. احصل على إحداثيات مراكز العائد على الاستثمارات للقناة G والقناة B. حفظ الجدول ك beads.csv.

في الصورة J، استخدم الإضافات المثبتة لتثبيت الماكروين، فحص العائد على الماكرو جولجي وإخراج البيانات الثلاثية للماكرو. امسح نافذة مدير العائد على الاستثمار والنتائج. افتح مجموعة من صور جولجي ميني-ستيك تتكون من ثلاثة ملفات TIFF.

قم بتوليد صور خلفية مطروحة كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو لاستخدامها لاحقا. ثم قم بتكرار الصور. تحت المعالجة، حاسبة الصور، أضف صور القناة G والقناة R والقناة B التي تم طرحها في الخلفية.

إلى الصورة الناتجة تحت الصورة، التعديل، العتبة، اختر تعيين لإدخال واحد كأدنى مستوى عتبة. تحت قسم التحليل، تحليل الجسيمات، أدخل نطاق الحجم الخاص بحجم البكسل أيضا. أدخل 50 إلى ما لا نهائي، تحقق من الاستثناءات على الحواف، وأضيف إلى المدير.

بعد ذلك، استخدم الصورة، اللون، دمج القنوات، لدمج الصور الثلاث الخلفية التي تم طرحها سابقا عن طريق اختيار القناة R كحمراء، القناة G كخضراء، والقناة B كزرقاء. ثم قم بتشغيل فحص العائد على الاستثمار في ماكرو جولجي باختيار الإضافات، الماكرو، فحص العائد على الاستثمار في جولجي. من المهم اختيار أكبر عدد ممكن من العائد على الاستثمار الذي يحتوي على مجموعات جولجي مصغرة واحدة في مجموعة من الصور.

تحت التحليل، قم بتعيين القياسات، وتحقق فقط من المساحة، ومتوسط القيمة الرمادية، ومركز الكتلة. جمع البيانات عن طريق تشغيل أداة الماكرو لمخرج ماكرو لبيانات بثلاث قنوات. انسخ إحداثيات المراكز في جدول بيانات بالترتيب المدرج هنا.

ثم احفظ الجدول ك ministacks.csv. انتقل إلى تصحيح الإزاحة الكروماتيكية للمراكز وحساب نسبة التمركز أو LQ وفقا لبروتوكول النص. المجهر الضوئي الحديث البحثي المزود بعدسة أبكروما بسيطة مثل المستخدمة هنا يظهر إزاحة لونية طفيفة.

ومع ذلك، فإن الفحص الدقيق لصورة الخرزة متعددة الألوان يكشف عن ذلك. تعرف مراكز التألق الأحمر بأنها المواقع الحقيقية للخرز. يمكن تمثيل الانزياحات اللونية النسبية للفلورة الخضراء والحمراء البعيدة بواسطة متجهات.

يتم توضيح التحول الكروماتيكي داخل مستوى التصوير بواسطة المتجه الأخضر والأزرق لكل خرزة. كما هو موضح هنا، يقلل تصحيح الإزاحة اللونية بشكل كبير من الانزاحة اللونية. في الخلايا الثديية، يتجمع مركب جولجي في المنطقة المحيطة بالنواة، والتي عادة لا تكون قابلة للحل تحت المجهر البصري التقليدي.

بعد معالجة نوكودازول، يختفي مركب جولجي حول النواة وتتجمع عشرات المداخن الصغيرة من جولجي في مواقع خروج الشبكة الإندوبلازمية في جميع أنحاء السيتوبلازم. تظهر هنا صورة نموذجية تم إنشاؤها باستخدام تحليل الصور المعروض في هذا الفيديو. باستخدام أداة فحص ROI ماكرو جولجي، تم سرد 40 مكدس جولجي مصغر مختار.

بعد تطبيق المعايير الثلاثة، كان يمكن تحليل 21 مكدس جولجي مصغر لحساب LQs ل TPST1-EGFP. بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجاز هذه التقنية خلال ساعة واحدة بعد وضع علامات الفلورة. بعد تطويرها، مهدت هذه الطريقة الطريق للباحثين الذين يدرسون جهاز جولجي لتحديد موقع كمية لبروتين جولجي بدقة تعادل دقة المجهر المناعي الإلكتروني.