أسلوب LC-MS/MS الأمثل لتحليل العينات السريرية إيفاكافتور، والايضات الرئيسية، ولوماكافتور في السوائل البيولوجية لمرضى التليف الكيسي الفائق

هذا هو البروتوكول الخاص بتحضير العينات لمقايسة البلازما. يرجى ملاحظة أنه لضمان سلامتها، يجب حفظ جميع العينات والمعايير في درجة حرارة تتراوح بين 2 إلى 8 درجة مئوية أثناء الجمع والمعالجة. وبمجرد الانتهاء من التعامل معها، تُخزن جميع العينات في درجة حرارة -20 درجة مئوية.

بالنسبة للتحضير القياسي، قم بتحضير محلولين مخزنين مستقلين من كل من الأنيليد، وivacaftor، والمستقلب M1، والمستقلب M6، وlumacaftor في الميثانول بتركيز 100 µg/mL و 10 µg/mL. يرجى ملاحظة أن المركبات تنتهي صلاحيتها بعد 10 أيام من وضعها على سطح المختبر. وبالنسبة للمعايير، انقل 100 µL من بلازما الإنسان إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة من البولي بروبيلين سعة 1.5 mL.

استمر في القيام بذلك لجميع العينات الأخرى. ثم أضف المعيار الداخلي إلى كل أنبوب. على سبيل المثال، نختار 0.01 µg/mL من المعيار المُحضّر.

يحتوي هذا الأنبوب الآن على بلازما مضاف إليها المعيار الداخلي. استمر في هذه العملية مع جميع المعايير الأخرى. خذ المعايير وقم بطردها مركزياً لبضع ثوانٍ للتأكد من أن جميع السوائل موجودة في قاع الأنبوب.

استمر في القيام بذلك لجميع المعايير الـ 40. وبالنسبة لعينات المرضى، انقل 100 µL من أنبوب عينة المريض إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. عينة المريض الحقيقية لا تكون مدعمة بمعيار داخلي.

قم بطرد عينة المريض مركزياً لبضع ثوانٍ للتأكد من أن جميع السوائل في قاع الأنبوب. الخطوات التالية مصممة لكل من العينات والمعايير. أضف 200 µL من 0.1% formic acid في acetonitrile إلى كل أنبوب عينة لترسيب بروتينات البلازما.

كرر هذه العملية لجميع المعايير وعينات المرضى. قم برج كل عينة بقوة باستخدام جهاز vortex لمدة 15 ثانية تقريبًا. استمر في القيام بذلك لجميع المعايير والعينات التي تعرضت للعقار.

اتركه لمدة 10 دقائق في الثلاجة لتسهيل عملية الترسيب. ولأغراض التوضيح، سأقوم بطرد مركزي لعينة واحدة ومعيار واحد فقط. سنقوم بإجراء الطرد المركزي بسرعة 10,000 rpm لمدة 10 دقائق باستخدام جهاز Eppendorf Centrifuge 5430 عند درجة حرارة أربع درجات.

سنقوم الآن بترشيح السائل الطافي في قوارير Phenomenex. وللقيام بذلك، نستخدم مرشح سرنجة بمقاس 13 ملم مع مرشحات نايلون Grace بمسامية 0.45 micrometers تم شراؤها من USA، ونقوم بالترشيح في قوارير HPLC التي تتسع لـ 1.5 milliliters. وبعد الترشيح، سننقل 100 microliters من السائل الطافي إلى قوارير LC/MS لإجراء تحليل LC/MS.

هذه العينة الآن جاهزة للتحليل. الآن، قم ببساطة بوضع جميع عيناتك في حامل القوارير. نحن نستخدم نظام Shimadzu 8030 LC/MS، المقترن بمطياف كتلة ثلاثي الرباعيات.

اترك النظام ليصل إلى حالة التوازن قبل البدء في التحليل. وبمجرد حدوث التوازن، وهو ما يستغرق حوالي 15 دقيقة، اضغط على زر Start. وبالنسبة لكل مستخلص أيضي، قم بإنشاء منحنى معايرة عن طريق رسم نسب مساحة القمة للأنيليدات مقابل التركيز الاسمي لمعايير المعايرة.

استخدم معادلة الانحدار لمنحنى المعايرة لحساب تركيزات الأنيليدات في العينة المستمدة. يظهر في هذا الشكل كروماتوغرام نموذجي. تم الحصول على دقة فصل كروماتوغرافية مُحسَّنة باستخدام طور متحرك يتكون من 100% acetonitrile و0.1% formic acid في الماء مع شطف متدرج على عمود Phenomenex Kinetex C8.

كانت أوقات الاستبقاء في تقنية LC كما يلي: دقيقة واحدة لـ M6، و1.3 دقيقة لـ M1.

بالنسبة لـ ivacaftor، كانت المدة 1.55 دقيقة. وبالنسبة لـ lumacaftor، كانت 2.3 دقيقة. وفي جميع عينات البلازما الفارغة، لم يُلاحظ أي تداخل مع زمن الاستبقاء لأي من الأنيليدات، كما لم يتم اكتشاف أي تداخل ناتج عن دمج ivacaftor مع lumacaftor.

من خلال التحليل عالي الإنتاجية لمجموعة كبيرة من عينات المرضى، قمنا بتحسين طريقتنا المُبلغ عنها عن طريق استخدام عمود كروماتوغرافيا الطور المعكوس ذو حجم مسام أصغر من نوع Phenomenex C8، ونظام مذيبات متدرج بدلاً من الشطف متساوي التركيز الحالي. يؤدي ذلك إلى تقليل وقت التشغيل إلى ست دقائق لكل عينة، بما في ذلك مرحلة الغسل. توفر هذه الطريقة الموثوقة والمبتكرة نهجاً بسيطاً وحساساً وسريعاً للمراقبة الدوائية العلاجية لـ ivacaftor ومزيج ivacaftor-lumacaftor في السوائل البيولوجية.

نظرًا للحاجة إلى تطوير علاقات الاستجابة للتعرض لتحقيق أقصى قدر من فعالية الدواء والحد من تكاليف الرعاية الصحية، فمن الضروري تطوير والتحقق من صحة أدوات أكثر حساسية لمساعدة الأطباء في استخدام العلاج القائم على الأدلة والتقنيات التحليلية عالية الإنتاجية للمرضى الذين يعانون من CF. ومن خلال تطبيق الطريقة التحليلية المقترحة على الدراسات السريرية للحركية الدوائية والديناميكا الدوائية، تظهر الفرصة لمزيد من الاستقصاء حول بارامترات الحركية الدوائية لـ ivacaftor أو مزيج ivacaftor-lumacaftor على مجموعة أكبر من المرضى.