أسلوب LC-MS/MS الأمثل لتحليل العينات السريرية إيفاكافتور، والايضات الرئيسية، ولوماكافتور في السوائل البيولوجية لمرضى التليف الكيسي الفائق
أكتوبر 15, 2017
الجمع بين إيفاكافتور وإيفاكافتور-لوماكافتور هما أدوية جديدة لقوات التحالف. ومع ذلك، لا يزال هناك ندرة في التفاهم على PK/PD والصيدلة. نقدم أسلوب [هبلك]--مايكروسوفت أمثل للتحليل المتزامن إيفاكافتور ووالايضات الرئيسية، ولوماكافتور.
هذا هو بروتوكول تحضير العينة لمقايسة البلازما. يرجى ملاحظة أنه لضمان سلامتها ، يجب الاحتفاظ بجميع العينات والمعايير عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية أثناء الجمع والمعالجة. بمجرد اكتمال المناولة ، قم بتخزين جميع العينات عند 20 درجة تحت الصفر.
للتحضير القياسي ، قم بإعداد محلين مستقلين لكل أنيليد ، إيفاكافتور ، مستقلب M1 ، مستقلب M6 ، ولوماكافتور في الميثانول بمعدل 100 ميكروغرام لكل مليلتر و 10 ميكروغرام لكل مليلتر. يرجى ملاحظة أن المركبات تنتهي صلاحيتها بعد 10 أيام على سطح المقعد. بالنسبة للمعايير ، قم بنقل 100 ميكرولتر من البلازما البشرية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة من مادة البولي بروبيلين سعة 1.5 ملليلتر.
استمر في القيام بذلك لجميع العينات الأخرى. ثم أضف المعيار الداخلي لكل أنبوب. على سبيل المثال ، نختار 0.01 ميكروغرام لكل مليلتر من المعيار المعد.
الآن يحتوي هذا الأنبوب على بلازما مثبتة بالمعيار الداخلي. تابع على هذا النحو مع جميع المعايير الأخرى. خذ معاييرك وقم بتدويرها لبضع ثوان للتأكد من أن كل السائل في قاع الأنبوب.
استمر في القيام بذلك لجميع المعايير الأربعين الخاصة بك. بالنسبة لعينات المريض ، قم بنقل 100 ميكرولتر من أنبوب عينة المريض إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. عينة المريض الحقيقية لا ترتفع بالمعايير الداخلية.
قم بتدوير عينة المريض لبضع ثوان للتأكد من أن كل السائل في قاع الأنبوب. تم تصميم الخطوات التالية للعينات والمعايير. أضف 200 ميكرولتر من حمض الفورميك 0.1٪ في الأسيتونيتريل في كل أنبوب عينة لترسيب بروتينات البلازما.
استمر في القيام بذلك لجميع المعايير وعينات المرضى. دوامة كل عينة بقوة لمدة 15 ثانية تقريبا. استمر في القيام بذلك لجميع المعايير والعينات المتكبدة.
اتركيه لمدة 10 دقائق في الثلاجة لتسهيل هطول الأمطار. لأغراض التوضيح ، سأقوم فقط بالطرد المركزي عينة واحدة ومعيار واحد. نحن نقوم بالطرد المركزي عند 10 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق على جهاز طرد مركزي Eppendorf 5430 عند أربع درجات.
سنقوم الآن بتصفية المادة الطافية في قوارير Phenomenex. لهذا ، نستخدم مرشح حقنة 13 ملم مع مرشحات نايلون جريس 0.45 ميكرومتر تم شراؤها من الولايات المتحدة الأمريكية ، ونقوم بالتصفية في قوارير HPLC التي يمكن أن تحتوي على 1.5 ملليلتر. بعد الترشيح ، سنقوم بنقل 100 ميكرولتر من المادة الطافية إلى قوارير LC / MS لتحليل LC / MS.
هذه العينة جاهزة الآن للتحليل. الآن ببساطة ضع جميع عيناتك في رف القارورة. نحن نستخدم نظام Shimadzu 8030 LC / MS ، إلى جانب مواصفات كتلة ثلاثية الأطباق.
دع النظام يتوازن قبل التحليل. بمجرد التوازن ، والذي يستغرق حوالي 15 دقيقة ، ما عليك سوى الضغط على زر البدء. لكل مستقلب ، قم ببناء منحنى معايرة عن طريق رسم نسب مساحة الذروة للأنيليلدات مقابل التركيز الاسمي لمعايير المعايرة.
استخدم معادلة الانحدار لمنحنى المعايرة لحساب تركيزات الأنيليدات في العينة المتكبدة. يظهر مخطط كروماتوغرام نموذجي في هذا الشكل. تم الحصول على دقة كروماتوغرافية محسنة باستخدام مرحلة متحركة من 100٪ أسيتونيتريل و 0.1٪ حمض الفورميك في الماء مع شطف متدرج على عمود Phenomenex Kinetex C8.
كانت أوقات الاحتفاظ بخطابات الاعتماد على النحو التالي. بالنسبة إلى M6 ، دقيقة واحدة. ل M1 ، 1.3 دقيقة.
لإيفاكافتور ، 1.55 دقيقة. لللوماكفتور ، 2.3 دقيقة. في جميع عينات البلازما الفارغة ، لم يلاحظ أي تداخل في وقت الاحتفاظ بأي من الأنيليدات ، ولم يتم اكتشاف تداخل من مزيج من إيفاكفتور مع لوماكفتور.
من خلال تحليل الإنتاجية العالية لكمية كبيرة من عينات المرضى ، قمنا بتحسين طريقتنا المبلغ عنها من خلال استخدام عمود كروماتوغرافيا الطور المعكوس بحجم المسام الأصغر Phenomenex C8 ونظام المذيبات المتدرجة بدلا من الشطف المتساوي الحالي. هذا يقلل من وقت التشغيل إلى ست دقائق لكل عينة ، بما في ذلك مرحلة الغسيل. تقدم هذه الطريقة الموثوقة والجديدة نهجا بسيطا وحساسا وسريعا لمراقبة الأدوية العلاجية لمزيج إيفاكافاتور وإيفاكافتور لوماكافتور والسوائل البيولوجية.
نظرا للحاجة إلى تطوير علاقات التعرض والاستجابة لزيادة فعالية الدواء إلى أقصى حد بالإضافة إلى احتواء تكاليف الرعاية الصحية ، يجب تطوير أدوات أكثر حساسية والتحقق من صحتها لمساعدة الأطباء في استخدام العلاج القائم على الأدلة والتقنيات التحليلية عالية الإنتاجية للمرضى الذين يعانون من CF.By تطبيق الطريقة التحليلية المقترحة على الدراسات الدوائية والديناميكية الدوائية السريرية ، تنشأ الفرصة لمزيد من التحقيق في معايير الحركية الدوائية ل ivacaftor أو مزيج Ivacaftor-lumacaftor على مجموعة أكبر من المرضى.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة تقنية HPLC-MS محسنة لتحليل متزامن لإيفاكافتور والعديد من مستقلباته الرئيسية، وكذلك لوماكافتور. لم يتم فهم الدوائية وعلم الأدوية لهذه الأدوية الجديدة لمرض التليف الكيسي بشكل جيد، مما يبرز الحاجة إلى تحسين الطرق التحليلية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- الصيدلة
- الكيمياء التحليلية
- بحوث التليف الكيسي
الخلفية
- إيفاكافتور ولوماكافتور هما دواء جديدان لمرض التليف الكيسي.
- هناك معرفة محدودة بشأن خصائص الدوائية وعلم الأدوية لديهما.
- الطرق المحسنة لتحليل الدواء ضرورية لفهم تأثيراتها.
- HPLC-MS هي تقنية قوية لتحليل الدواء.
غرض الدراسة
- لتطوير طريقة موثوقة لتحليل إيفاكافتور ولوماكافتور.
- لتقييم الدوائية لإيفاكافتور ومستقلباته.
- لتعزيز فهم تفاعلات الدواء وفعاليته.
الطرق المستخدمة
- تحضير العينة لفحص البلازما.
- تخزين العينات في درجات حرارة متحكم بها.
- تحضير المحاليل الأساسية في الميثانول.
- استخدام HPLC-MS للتحليل المتزامن.
النتائج الرئيسية
- التطوير الناجح لتقنية HPLC-MS محسنة.
- تم تحقيق تحليل إيفاكافتور ومستقلباته.
- أظهرت الطريقة موثوقية للدراسات الدوائية.
- تم الحصول على رؤى حول دوائية أدوية التليف الكيسي.
الاستنتاجات
- يمكن أن تساعد الطريقة المحسنة في فهم سلوك الدواء.
- هناك حاجة لدراسات إضافية لاستكشاف علم الأدوية.
- التقنيات التحليلية المحسنة ضرورية لتطوير الدواء.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Accelerated pharmacokinetic profiling of CFTR modulators is critical for optimizing dosing regimens and understanding exposure-response relationships in cystic fibrosis. This high-throughput LC-MS/MS method enables rapid quantification of ivacaftor, its metabolites, and lumacaftor, supporting larger-scale clinical studies and de-risking translational development. Reduced analysis time from 15 to 6 minutes per sample enhances laboratory throughput, facilitating population PK/PD investigations and portfolio-level decision-making for CF therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise measurement of drug and metabolite concentrations to interrogate CFTR modulation mechanisms and pathway engagement.
- Operational Value: Provides reproducible quantitative outputs for assessing target exposure in preclinical models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers sensitive, selective detection of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological matrices.
- Operational Value: Gradient elution on sub-2µm C8 column ensures chromatographic resolution and assay robustness for high-throughput workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports exposure-response modeling by generating reliable PK data from CF patient samples.
- Operational Value: Enables scalable sample processing for clinical PK studies, bridging discovery to clinical validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-translational continuum, supporting hypothesis testing in early discovery, assay readiness in screening, and quantitative readouts for preclinical and clinical PK evaluation.
- Discovery Biology: Facilitates target engagement assessment through accurate metabolite profiling in biological systems.
- Screening: Ensures assay standardization and reproducibility for reliable compound evaluation across sample sets.
- Analytics: Provides peak area ratio-based quantification and calibration curves for precise concentration determination.
- Translational Research: Connects analytical output to clinical exposure metrics, enabling PK/PD correlation in patient populations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable analytical platform for CFTR modulator programs, reducing method redevelopment effort.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in drug exposure assessment, reduction of PK uncertainty in CFTR modulator studies.
- Operational Value: High-throughput capability, method sensitivity, and rapid turnaround for large sample cohorts.
- Strategic Value: Informed go/no-go decisions based on exposure data, improved capital efficiency in clinical development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of CF drug candidates using robust PK/PD datasets.
Implementation Considerations
- Expertise in LC-MS/MS method development and biological sample handling.
- Access to triple-quadrupole mass spectrometry and gradient HPLC systems.
- Standardization of sample preparation, protein precipitation, and filtration protocols.
- Adaptation considerations for different biological fluids (e.g., plasma, sputum) and stability monitoring.
- Requirement for controlled storage conditions (−20°C) and fresh standard preparation within 10-day stability window.
