نموذج إعداد وتحليل البيانات التعبير الجيني على أساس رناسيق من الزرد

الهدف العام من تحليل RNASeq هذا في عينات يرقات سمك الزرد هو تحديد ملامح التعبير الجيني لأجنة الزرد واليرقات وتقديم بيانات مقارنة كمية حول تغيرات التعبير الجيني بين العينات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في أي مجال تكون فيه أجنة أو يرقات أسماك الزرد مفيدة ، مثل كيف يؤدي قمع أحد الجينات المستهدفة إلى تغييرات في التعبير الجيني أو تعطيل مسارات معينة بالنسبة لحالات أخرى. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن أسماك الزرد قابلة لإنتاج أعداد كبيرة من ، ويمكن الحصول بسهولة على بيانات نسخ الكاملة.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحقيق عزل أنواع معينة من الخلايا بسهولة باستخدام فرز المعدلة وراثيا. سيوضح الإجراءات لين هوستلي ، طالبة دراسات عليا ، وجيسيكا نيسميث ، طالبة ما بعد الدكتوراه من مختبري. للبدء ، زراعة الأجنة حتى عمر ثلاثة أشهر ، وهو النضج الإنجابي.

افصل اثنين من الأسماك البالغة من الذكور وثلاث أنثى من السلالة المرغوبة إلى أحواض تزاوج مقسمة من مياه النظام العذب في المساء قبل جمع الأجنة. في صباح اليوم التالي ، بعد أن تضيء الأضواء ، قم بإزالة الحاجز ، واترك الأسماك تتزاوج بشكل طبيعي حتى يتم ملاحظة الأجنة في قاع الخزان. اجمع الأجنة على فترات 30 دقيقة في أطباق بتري منفصلة من وسط الجنين حتى يتم جمع العدد المطلوب.

لتنظيم الأجنة ، قم بزراعتها في مجموعات من 50 إلى 75 لكل 10 سنتيمترات طبق بتري لتعزيز توقيت النمو المتسق لجميع الأجنة. ثم احتفظ بالصفائح عند 28.5 درجة مئوية. قم بقياس عمر الجنين باستخدام عدد الجسيدات بعد التجزئة حتى حوالي 24 ساعة بعد الإخصاب ، أو HPF ، وفصل الأجنة بناء على عمر النمو.

بعد القتل الرحيم للأجنة في المرحلة المرغوبة وفقا لبروتوكول النص ، انقل مجموعة من 20 جنينا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. ثم قم بإزالة أي وسط جنين زائد من أنبوب الطرد المركزي الدقيق. أضف 200 ميكرولتر من كاشف التحلل إلى الأنبوب.

واستخدم مدقة لتجانس الأجنة ميكانيكيا. بعد ذلك ، أضف 800 ميكرولتر إضافي من كاشف التحلل ليصل الحجم الإجمالي إلى مليلتر واحد. لاستخراج الحمض النووي الريبي ، أضف كاشف التحلل إلى العينة التي تم جمعها واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.

أضف 0.2 مل من الكلوروفورم لكل 1 مليلتر من كاشف التحلل المستخدم ، واقلب الأنابيب يدويا لمدة 15 ثانية. بعد احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 12 ، 000 مرة G و 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. انقل المرحلة المائية المنفصلة إلى أنبوب جديد وأضف 0.5 مل من الأيزوبروبانول لكل 1 مليلتر من كاشف التحلل المستخدم.

بعد احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، قم بالطرد المركزي للعينات لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، أضف 75٪ من الإيثانول إلى الحمض النووي الريبي وقم بالطرد المركزي للأنابيب عند 7 ، 500 مرة جم و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية تماما واترك العينة تجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، أعد تعليق الحمض النووي الريبي في 15 إلى 30 ميكرولترا من المياه المعالجة DEPC. لتنقية الحمض النووي الريبي عالي الجودة بعد استخراج الحبيبات وغسل العينة وفقا لبروتوكول النص ، استخدم مقياس الطيف الضوئي للامتصاص لفحص الحمض النووي الريبي المستخرج للتركيز والنقاء. تأكد من أن قيمة 260 على 230 تبلغ حوالي 2.0 قبل إرسال عينات الحمض النووي الريبي إلى بائع أو فيلق لتحليل تغيير التعبير الجيني RNASeq وبناء على التقدير الكمي لقراءات التسلسل.

لمقارنة حالة تجريبية واحدة مقابل عنصر تحكم ، افتح بيانات الجينات المعبر عنها تفاضليا في برنامج إدارة جداول البيانات. حدد سهم القائمة المنسدلة بجوار زر الفرز، وحدد فرز مخصص داخل جدول البيانات. في النافذة المنبثقة ، حدد المربع الموجود أسفل العمود واختر الفرز حسب عمود LFC.

في عمود الفرز على ، تأكد من تحديد القيم. في عمود الترتيب، حدد الفرز من الأكبر إلى الأصغر وانقر فوق موافق. لتحديد الجينات المعبر عنها تفاضليا الموجودة في حالتين تجريبيتين ، في جدول بيانات التجريبي مقابل جدول بيانات التحكم ، حدد الخلية الأولى في عمود فارغ.

ثم اكتب المعادلة التالية في الخلية. اضغط على Enter أو Return لتشغيل المعادلة. حدد الخلية التي تحتوي على المعادلة وانقر فوق المربع الموجود في الزاوية اليمنى السفلية من الخلية.

استمر في النقر بالماوس واسحب المنطقة المحددة لأسفل العمود حتى تحديد معرف الميزة الأخير لنسخ المعادلة إلى كل خلية في العمود. حدد فرز مخصص مرة أخرى وأضف مستوى ثان من الفرز بالنقر فوق أيقونة علامة الجمع في الزاوية اليسرى السفلية. في المستوى الأول، قم بالفرز حسب، ضمن العمود، حدد تكرارا.

ضمن فرز على، حدد القيم، وتحت الترتيب، حدد Z A.In المستوى الثاني، ثم حسب العمود، حدد LFC ضمن العمود. ضمن الفرز على، حدد القيم، وضمن الترتيب، حدد الأكبر إلى الأصغر، وحدد موافق. لإزالة أي أقواس من عمود رموز الجينات قبل المتابعة، حدد العمود بأكمله الذي يحتوي على رموز الجينات.

حدد تحرير، ثم استبداله في قائمة الملفات المنسدلة. اكتب الأقواس المفتوحة ، والنجمة ، والأقواس المغلقة ، في البحث عن شريط الاستبدال لنافذة الاستبدال ، واستئجار الاستبدال بقضيب فارغ. حدد استبدال الكل لإزالة جميع مثيلات الأقواس.

لتحديد المسارات المخصبة ، انسخ رموز الجينات المطلوبة إلى الحافظة. انتقل إلى ConsensusPathDB ، ثم حدد تحليل مجموعة الجينات على الشريط الجانبي الأيسر لصفحة الويب ، متبوعا بتحليل التمثيل الزائد. في مربع لصق قائمة بمعرفات الجينات والبروتينات، الصق قائمة الجينات.

حدد رمز الجين في مربع نوع معرف الجين / البروتين وانقر فوق متابعة. ضمن قسم المجموعات المستندة إلى المسار، حدد المربع بجوار المسارات كما هو محدد بواسطة قواعد بيانات المسار. حدد البحث عن مجموعات غنية للحصول على قائمة المسارات التي تحتوي على الجينات في قائمة الإدخال.

حدد جميع المسارات المخصبة للتصور في شبكة مسار إما عن طريق تحديد كل مربع بجوار أسماء المسارات أو، ضمن تحديد في رأس العمود أعلى مربعات التحديد، انقر فوق الكل. ثم حدد تصور المجموعات المحددة. اضبط فلاتر التداخل النسبي والمرشحين المشتركين عن طريق تحديد أي من المربعين في أعلى منتصف الصفحة وإدخال النسبة المئوية المطلوبة أو التداخل النسبي أو عدد المرشحين المشتركين، ثم حدد تطبيق.

لتحديد أنطولوجيا الجينات المخصبة ، انسخ رموز الجينات للمجموعة المعنية إلى الحافظة. انتقل إلى أداة تحليل تخصيب GO في اتحاد علم الوجود الجيني. على الجانب الأيسر من الصفحة ، أسفل معرفات الجينات الخاصة بك هنا ، الصق قائمة رموز الجينات في المربع.

أسفل مربع معرفات الجينات ، حدد مصطلح go ، العملية البيولوجية. بعد ذلك، حدد danio rerio أسفل مربع شروط الانتقال وانقر فوق إرسال. قم بإجراء QRT PCR ومقارنته ب RNASeq ، وفقا لبروتوكول النص.

تسلسل الحمض النووي الريبي المستخرج من اليرقات المحقونة ب Morpholinos مقابل الصدقات1 أو bbs1 عن الجينات التي تم تنظيمها بشكل فريد في نماذج Alstrom و BBS ، بالإضافة إلى الجينات التي تم تغييرها بشكل كبير في كلا النموذجين. لتوضيح المظهر الجزيئي لنموذج ألستروم بشكل أكثر وضوحا ، تم تحديد المسارات والأنطولوجيا الجينية المخصبة في الجينات المعبر عنها تفاضليا. كما هو موضح هنا ، تم تنظيم 31 مسارا إجماليا.

بصرف النظر عن التجميع الواسع لعملية التمثيل الغذائي ، كانت المسارات الأكثر تضررا هي الجهاز المناعي الفطري والتكيفي ، مع 32 و 20 جينا على التوالي. كما تم إثراء أحداث إشارات مستقبلات الخلايا البائية في اتجاه مجرى النهر. كما تم إثراء العديد من مسارات الإشارات بين الجينات المنظمة ، بما يتفق مع ارتباط متلازمة ألستروم بالخلل الوظيفي الأولي للأهداب.

بالإضافة إلى ذلك ، تم تنظيم ثلاثة مسارات مرتبطة بإفراز الأنسولين ، والأحماض الدهنية المرتبطة ب GPR40 ، والأحماض الدهنية الحرة ، والأستيل كولين. أخيرا ، تم إثراء ستة مصطلحات GO بين الجينات المنظمة في نموذج ألستروم ، بما في ذلك تمايز كريات الدم الحمراء ، وتوازن كريات الدم الحمراء ، وتوازن الخلايا النخاعية ، وعمليات الاستتباب. بمجرد إتقان ، يمكن إجراء تحليل المسار ومصطلح GO في أقل من ساعة.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن اختيار معلمات المسار وقيم القطع هي أهم الاعتبارات في تفسير نتائج مقارنات تعبير RNASeq. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل التطبيق مع الخطوط الطافرة وتحليل النسخ لأنواع الخلايا المفردة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل توصيف النسخ لأنواع الخلايا وتغييرات التعبير الجيني تحت سيطرة جينات معينة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام البيانات النسخية لسمك الزرد التي تم إنشاؤها بواسطة RNASeq لتحديد التغييرات المهمة في التعبير الجيني بين العينات التجريبية.