نموذج إعداد وتحليل البيانات التعبير الجيني على أساس رناسيق من الزرد

يتمثل الهدف العام من تحليل RNASeq في عينات يرقات سمك الزيبرا في تحديد أنماط التعبير الجيني لأجنة ويرقات سمك الزيبرا، وتقديم بيانات مقارنة كمية حول تغيرات التعبير الجيني بين العينات. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في أي مجال تكون فيه أجنة أو يرقات سمك الزيبرا مفيدة، مثل كيفيةما يؤدي تثبيط جين مستهدف واحد إلى تغيرات في التعبير الجيني أو تعطيل مسارات معينة مقارنة بظروف أخرى. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أن أسماك الزيبرا تسمح بإنتاج أعداد كبيرة من الحيوانات، كما يمكن الحصول بسهولة على بيانات الترانسكريبتوم للحيوان بأكمله.

بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحقيق عزل أنواع محددة من الخلايا بسهولة باستخدام فرز الحيوانات المعدلة وراثياً. سيقوم كل من لين هوستلي، طالبة دراسات عليا، وجيسيكا نيسميث، باحثة ما بعد الدكتوراه من مختبري، بتوضيح الإجراءات. للبدء، يتم استزراع الأجنة حتى يصل عمرها إلى ثلاثة أشهر، وهو سن النضج التناسلي.

اعزل سمكتين بالغتين من الذكور وثلاث من الإناث من السلالة المطلوبة في أحواض تزاوج مقسمة تحتوي على مياه نظام عذبة في المساء الذي يسبق عملية جمع الأجنة. وفي صباح اليوم التالي، بعد إضاءة الأنوار، قم بإزالة الفاصل، واترك الأسماك تتزاوج بشكل طبيعي حتى تُلاحظ الأجنة في قاع الحوض. اجمع الأجنة على فترات زمنية مدتها 30 minute في أطباق Petri منفصلة تحتوي على وسط أجنة حتى يتم جمع العدد المطلوب.

لتحديد المرحلة العمرية للأجنة، قم بزراعتها في مجموعات تضم من 50 إلى 75 جنيناً في كل طبق بتري بقطر 10 سنتيمتر لتعزيز اتساق التوقيت النمائي لجميع الأجنة. بعد ذلك، احفظ الأطباق عند درجة حرارة 28.5 درجة مئوية. قم بقياس عمر الجنين باستخدام عدد القطع العضلية (somite number) بعد عملية التقطيع حتى مرور 24 ساعة تقريباً بعد الإخصاب، أو HPF، ثم افصل الأجنة بناءً على عمرها النمائي.

بعد القتل الرحيم للأجنة في المرحلة المطلوبة وفقًا للبروتوكول النصي، انقل مجموعة مكونة من 20 جنيناً إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter مُصنف. بعد ذلك، قم بإزالة أي فائض من وسط نمو الأجنة من أنبوب الطرد المركزي الدقيق. أضف 200 microliters من كاشف التحلل إلى الأنبوب.

واستخدم مدقة لعمل تجانس ميكانيكي للأجنة. بعد ذلك، أضف 800 µL إضافية من كاشف التحلل ليصل الحجم الإجمالي إلى 1 mL. ولاستخلاص RNA، أضف كاشف التحلل إلى العينة التي تم جمعها وحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.

أضف 0.2 milliliters من الكلوروفورم لكل 1 milliliter من كاشف التحلل المستخدم، ثم اقلب الأنابيب يدويًا لمدة 15 ثانية. وبعد تحضين العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق، قم بطرد العينات مركزياً عند 12,000 ×g ودرجة حرارة 4 degrees Celsius لمدة 15 دقيقة. انقل الطور المائي المنفصل إلى أنبوب جديد وأضف 0.5 milliliters من الإيزوبروبانول لكل 1 milliliter من كاشف التحلل المستخدم.

بعد تحضين الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق، يتم طرد العينات مركزياً لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، أضف ethanol بتركيز 75% إلى الـ RNA واطرد الأنابيب مركزياً عند 7,500 ×g وبدرجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تخلص من الطافي تماماً واترك العينة لتجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، أعد تعليق الـ RNA في 15 إلى 30 µL من الماء المعالج بـ DEPC. ولتنقية RNA عالي الجودة بعد استخلاص الراسب وغسل العينة وفقاً للبروتوكول النصي، استخدم مقياس الطيف الضوئي الامتصاصي لتقدير تركيز الـ RNA المستخلص ونقاوته. تأكد من أن قيمة 260 over 230 تبلغ حوالي 2.0 قبل إرسال عينات الـ RNA إلى مورد أو مؤسسة لإجراء تحليل RNASeq وتحليل تغير التعبير الجيني بناءً على كمية قراءات التسلسل.

لمقارنة حالة تجريبية واحدة مقابل مجموعة ضابطة، افتح بيانات الجينات ذات التعبير المتباين في برنامج لإدارة الجداول الحسابية. اختر السهم المنسدل الموجود بجانب زر الفرز، ثم اختر "فرز مخصص" (custom sort) داخل الجدول الحسابي. في النافذة التي تظهر، حدد المربع الموجود أسفل "العمود" (column) واختر الفرز حسب عمود LFC.

في عمود الفرز، تأكد من اختيار "القيم". وفي عمود الترتيب، اختر الفرز من الأكبر إلى الأصغر ثم انقر موافق. ولتحديد الجينات ذات التعبير التفاضلي الموجودة في حالتين تجريبيتين، في جدول البيانات الخاص بالتجربة مقابل العينة الضابطة، حدد الخلية الأولى في عمود فارغ.

بعد ذلك، اكتب المعادلة التالية في الخلية. اضغط على enter أو return لتنفيذ المعادلة. حدد الخلية التي تحتوي على المعادلة وانقر فوق المربع الموجود في الزاوية اليمنى السفلية من الخلية.

استمر في النقر بزر الفأرة واسحب المنطقة المحددة إلى أسفل العمود تماماً حتى يتم تحديد آخر معرف ميزة (feature ID) لنسخ المعادلة في كل خلية في العمود. اختر "فرز مخصص" (custom sort) مرة أخرى وأضف مستوى ثانياً من الفرز بالنقر فوق أيقونة الزائد (+) في الزاوية السفلية اليسرى. في المستوى الأول، وفي خانة "الفرز حسب" (sort by)، وتحت "العمود" (column)، اختر "مكرر" (duplicate).

ضمن خيار "الفرز بناءً على" (sort on)، حدد "القيم" (values)، وضمن خيار "الترتيب" (order)، حدد "Z إلى A". في المستوى الثاني، "ثم حسب" (then by)، ومن قائمة "العمود" (column)، حدد LFC. ضمن خيار "الفرز بناءً على" (sort on)، حدد "القيم" (values)، وضمن خيار "الترتيب" (order)، حدد "من الأكبر إلى الأصغر" (largest to smallest)، ثم اختر "موافق" (okay). لإزالة أي أقواس من عمود رموز الجينات قبل المتابعة، حدد العمود بأكمله الذي يحتوي على رموز الجينات.

اختر "تعديل" (edit)، ثم "استبدال" (replace) من القائمة المنسدلة للملف. اكتب قوس فتح، ونجمة، وقوس إغلاق في شريط "البحث عن" (find what) في نافذة الاستبدال، واترك شريط "استبدال بـ" (replace with) فارغاً. اختر "استبدال الكل" (replace all) لإزالة جميع حالات الأقواس.

لتحديد المسارات المخصبة، انسخ رموز الجينات المطلوبة إلى الحافظة. انتقل إلى ConsensusPathDB، ثم اختر gene set analysis من الشريط الجانبي الأيسر لصفحة الويب، يليه over-representation analysis. وفي مربع paste a list of gene and protein identifiers، الصق قائمة الجينات.

حدد رمز الجين في مربع نوع معرف الجين/البروتين وانقر على المتابعة. ضمن قسم المجموعات القائمة على المسارات، حدد المربع المجاور للمسارات كما هي معرفة في قواعد بيانات المسارات. اختر "البحث عن المجموعات المثرية" للحصول على قائمة المسارات التي تحتوي على جينات موجودة في القائمة المدخلة.

حدد جميع المسارات المثرية المراد تصورها في شبكة المسارات، إما عن طريق تحديد كل مربع بجانب أسماء المسارات، أو بالنقر على "الكل" ضمن خيار "تحديد" في ترويسة العمود فوق مربعات الاختيار. بعد ذلك، اختر "تصور المجموعات المحددة". قم بضبط مرشحات التداخل النسبي والمرشحين المشتركين عن طريق تحديد أي من المربعين في أعلى وسط الصفحة وإدخال النسبة المئوية المطلوبة، أو التداخل النسبي، أو عدد المرشحين المشتركين، ثم اختر "تطبيق".

لتحديد الأنطولوجيات الجينية المثرية، انسخ رموز الجينات الخاصة بالمجموعة المعنية إلى الحافظة. انتقل إلى أداة تحليل إثراء GO في اتحاد الأنطولوجيا الجينية (Gene Ontology Consortium). في الجانب الأيسر من الصفحة، وتحت عبارة "your gene IDs here"، الصق قائمة رموز الجينات في المربع.

من أسفل مربع معرفات الجينات (gene IDs)، اختر مصطلح الـ GO، "العملية البيولوجية" (biological process). بعد ذلك، اختر danio rerio من أسفل مربع مصطلحات الـ GO وانقر على إرسال (submit). قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (QRT PCR) وقارن النتائج بتسلسل الحمض النووي الريبي (RNASeq)، وفقاً للبروتوكول النصي.

كشف تسلسل الـ RNA المستخلص من اليرقات المحقونة بـ Morpholinos ضد كل من alms1 أو bbs1 عن الجينات التي تم تنظيمها بالزيادة أو النقص بشكل فريد في نموذجي Alstrom وBBS، بالإضافة إلى الجينات التي تغيرت بشكل ملحوظ في كلا النموذجين. ولتوضيح المظهر الجزيئي لنموذج Alstrom بشكل أكثر دقة، تم تحديد المسارات والأنطولوجيات الجينية المثرى بها الجينات ذات التعبير التفاضلي. وكما هو موضح هنا، تم تنظيم 31 مساراً إجمالاً بالزيادة.

وبصرف النظر عن المجموعة الواسعة لعمليات التمثيل الغذائي، كانت المسارات الأكثر تأثراً هي الجهاز المناعي الفطري والتكيفي، بـ 32 و 20 جيناً على التوالي. كما كانت أحداث تأشير مستقبلات الخلايا البائية في المراحل اللاحقة مثرية أيضاً. كما ظهر إثراء في العديد من مسارات التأشير بين الجينات التي زاد تعبيرها، وهو ما يتوافق مع ارتباط متلازمة ألستروم بخلل وظيفة الهدب الأولي.

بالإضافة إلى ذلك، تم زيادة تنظيم ثلاثة مسارات مرتبطة بإفراز الإنسولين، وهي الأحماض الدهنية المرتبطة بـ GPR40، والأحماض الدهنية الحرة، والأسيتيل كولين. وأخيرًا، تم إثراء ستة مصطلحات GO بين الجينات التي زاد تنظيمها في نموذج Alstrom، بما في ذلك تمايز كريات الدم الحمراء، وتوازن كريات الدم الحمراء، وتوازن الخلايا النخاعية، والعمليات الاستتبابية. وبمجرد إتقانها، يمكن إجراء تحليل المسارات ومصطلحات GO في أقل من ساعة.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن اختيار معاملات المسار وقيم القطع هي أهم الاعتبارات عند تفسير نتائج مقارنات التعبير الجيني باستخدام RNASeq. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل التطبيق على السلالات الطافرة وتحليل الترانسكريبتوم لأنواع الخلايا المفردة، وذلك للإجابة على أسئلة إضافية، مثل توصيف الترانسكريبتوم لأنواع الخلايا وتغيرات التعبير الجيني الخاضعة لسيطرة جينات محددة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام بيانات الترانسكريبتوم لسمك الزيبرا الناتجة عن RNASeq لتحديد التغيرات الجوهرية في التعبير الجيني بين العينات التجريبية.