تحليل التعبير الجيني العالمي باستخدام ميكروأري قليل النوكليوتيد منهاج اسماك الزرد

يبدأ هذا الإجراء ب CDNA الذي تم تصنيعه من قالب من الحمض النووي الريبي عالي الجودة. تم تصنيف CDNA لأول مرة بصبغة الفلورسنت SI ثلاثة. عند الانتهاء من تفاعل الملصقات ، يتم تنقية CDNA المسمى وعزله وتقييم جودة تفاعل وضع العلامات.

ثم يتم تهجين CDNA المسمى على مصفوفة دقيقة. بعد التهجين ، يتم تحليل المصفوفات لتحديد المستويات النسبية للتعبير الجيني في العينات. مرحبا ، اسمي سام بيترسون من مختبر الدكتورة جينيفر فريمان في كلية العلوم الصحية بجامعة بوردو.

السابق ، أوضحنا لك كيفية استخراج الحمض النووي الريبي من أجنة أسماك الزرد وتحويل هذا الحمض النووي الريبي إلى CDNA. سنعرض لك اليوم إجراء لوضع العلامات على CDNA وتهجينه على منصة المصفوفة الدقيقة لأسماك الزرد ، oligo nucleotide لدراسة ملفات تعريف التعبير الجيني العالمية. عادة ، نستخدم هذا الإجراء لدراسة التعبير الجيني التفاضلي استجابة للتعرض لمادة سامة.

لذلك دعونا نبدأ. تتطلب تجربة المصفوفة الدقيقة بيئة ضوئية ضئيلة لمنع تدهور الصور لصبغة الفلورسنت SI ثلاثة المستخدمة في وضع العلامات لبدء تسمية CD NA بالعلوم ثلاثة المكونات التالية لنظام وضع العلامات الجينومية CGH على المصفوفة الأولية الحيوية 2.5 × مخزن مؤقت أولي عشوائي ، 10 مزيج X-D-C-T-P والماء الخالي من النوكلياز. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإذابة مخزون واحد مليمولار من SI الثلاثة المسمى DCTP بعد الذوبان ، أو جهاز الطرد المركزي أو الكواشف لفترة وجيزة في أنبوب بجدران بسمك 0.6 مليلتر مجتمعة.

500 نانوجرام من CDNA 40 ميكرولتر ، 2.5 × عازلة أولية عشوائية وماء خال من نوكلياز لتحقيق حجم إجمالي يبلغ 86 ميكرولترا. تخلط جيدا وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة ، ثم تحتضن التفاعل عند مائة درجة مئوية في جهاز تدوير حراري لمدة خمس دقائق. في نهاية الحضانة ، انقل التفاعل على الفور إلى ملاط حمام جليدي لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، أخرج بوليميراز الحمض النووي الخارجي من الفريزر وضعه على الثلج. ثم أضف إلى أنبوب التفاعل ، 10 ميكرولتر من 10 X-D-C-T-P امزج ميكرولترين من مليمولار SI 3D CTP واثنين من ميكرولترين من بوليميراز الحمض النووي لتنظيف XO ممزوجا جيدا وجهاز طرد مركزي لفترة وجيزة. أخيرا ، احتضان التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة وجهاز تدوير حراري عند الانتهاء من وضع العلامات.

تابع تنظيف وتعجيل CDNA المسمى. لبدء تنظيف CDNA المسمى. ضع عمود MicroCon في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر.

أضف 300 ميكرولتر صفر 0.1 XSSC إلى العمود ثم أضف تفاعل وضع العلامات. الطرد المركزي العمود عند 16 ، 100 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات SIUs. لاحظ أن التدفق من خلال قد يكون ورديا فاتحا.

تخلص من التدفق وأضف 300 ميكرولتر أخرى من 0.1 XSSE إلى العمود. ثم كرر الطرد المركزي عند 16 ، 100 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. مرة أخرى ، تخلص من التدفق وأضف 300 ميكرولتر إضافي T 0.1 XSSC إلى العمود الآن جهاز طرد مركزي عند 16 ، 100 جم لمدة 12 دقيقة عند أربع درجات مئوية بعد هذا الغسيل الأخير.

يجب أن يكون التدفق واضحا وأن يكون CDNA المسمى باللون الوردي مرئيا على العمود. مرة أخرى ، تجاهل التدفق من هذا الغسيل النهائي لتفادي القرص المضغوط NA المسمى. أضف 100 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز إلى العمود. خذ العمود من أنبوب الطرد المركزي الصغير ومقلوب في أنبوب جديد.

ثم قم بالطرد المركزي للعمود المقلوب عند 2 ، 300 جم لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية. يتم إذابة CDNA المسمى في الماء في قاع الأنبوب. تحقق من CDNA المشار إليه باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop ND 1000 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

احسب تركيز الحمض النووي وقم بتقييم دمج الصبغة كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المصاحب. إذا تم تصنيف CDNA بشكل كاف ، فضع ستة ميكروغرامات في أنبوب جديد لترسيب مزيج CD NA المسمى في حجم 0.1 × من ثلاثة أسيتات الصوديوم المولية عند درجة الحموضة 5.2 وحجم x واحد. يحتضن الأيزوبروبانول الظلام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

مع الأخذ في الاعتبار ، تم تنفيذ جميع الخطوات حتى هذه النقطة في بيئة ضوئية ضئيلة. ثم قم بالطرد المركزي للعينة عند 16 ، 100 جم لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، تخلص بعناية من مادة SUP الطبيعية دون إزعاج حبيبات الحمض النووي ، وهي وردية.

أخيرا يتم غسلها بإضافة 500 ميكرولتر و 70٪ من الإيثانول وخلطها بواسطة جهاز طرد مركزي مقلوب لطيف عند 16 ، 100 جم لمدة خمس دقائق. في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة السوبينات ، واقلب الأنبوب ، واترك الحبيبات تجف لمدة خمس دقائق. CDNA المسمى جاهز للتهجين.

قبل البدء في التهجين ، قم بتشغيل نظام التهجين المولد الذكي واتركه يتوازن إلى 42 درجة مئوية. ابدأ بإذابة حبيبات CD NA المسمى في خمسة ميكرولترات من الماء الخالي من النوكلياز إلى الحبيبات المذابة. أضف مكونات التهجين من مجموعة Roche Nimble Gen Hybridization Kit Hybridization Hybrid A و oligo المحاذاة إلى حجم إجمالي يبلغ 18 ميكرولترا كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المصاحب.

تخلط جيدا وتدور لفترة وجيزة لجمع المحتويات في الأسفل. بعد ذلك ، المسمى CDNA عن طريق وضع الأنبوب عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. انقل الأنبوب على الفور إلى نظام التهجين الذكي حتى تصبح المصفوفات جاهزة.

لاحظ أن المصفوفات الدقيقة تتطلب معالجة وتخزين دقيقين. يتم تخزين مصفوفات Roche الذكية في الظلام مع المجفف في درجة حرارة الغرفة. قم بتحميل المصفوفة في أداة محاذاة الخلاط الدقيق.

يتم تحميل PMA T في خلاط X واحد على PMA T وإزالة الشريط اللاصق بالملقط. مع تحميل المصفوفة والخلاط، أغلق PMA T بإحكام. بعد ذلك ، قم بفصل المصفوفة والخلاط عن PMA T عن طريق الضغط على الخلاط من خلال الفتحة الموجودة في PMA t.

أخيرا ، استخدم براير للضغط حول الجزء الخارجي من الخلاط للتأكد من أن المصفوفة محكمة الغلق وإزالة أي فقاعات. بعد ذلك ، ضع مجمع خلاط المصفوفة على نظام التهجين للتدفئة ، لتحميل عينة CDNA على المصفوفة. استخدم الإزاحة ببطء وبضغط ثابت.

أضف 15 ميكرولترا من العينة الملصقة في منفذ التعبئة في وسط الخلاط. امسح أي عينة زائدة من فتحات المنفذ وأغلقها بشرائط لاصقة. ثم أغلق المزلاج.

ابدأ الآن في خلط محلول التهجين باستخدام البرنامج B على نظام التهجين المولد الذكي. اسمح للمصفوفة الدقيقة بالتهجين لمدة 16 إلى 20 ساعة بعد التهجين ، سيتم غسل المصفوفة الدقيقة ومسحها ضوئيا عندما يقترب التهجين من الانتهاء. استعد للمسح عن طريق تشغيل الماسح الضوئي لقطات الجينات 4 ، 000 B واتركه يسخن لمدة 15 دقيقة تقريبا.

بعد ذلك ، قم بإعداد مخازن الغسيل واحدة A و B و Two و Three كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المصاحب. قم بتخزين المخزن المؤقت للغسيل قبل الحرب من واحد A إلى 42 درجة مئوية ، لكن اترك المخازن المؤقتة الأخرى في درجة حرارة الغرفة. عندما يسخن المخزن المؤقت للغسيل ، اسكبه في طبق.

اغمر رف الشرائح في مخزن الغسيل المخزن المؤقت ب ، الآن قم بإزالة مجمع خلاط المصفوفة من نظام التهجين الجنرال الذكي وانزلق إلى الرقصة. ابدأ الغسيل عن طريق غمر المجموعة في مخزن الغسيل الدافئ واحد أ وقم بإزالة الخلاط بعناية عن طريق تقشيره بعيدا عن الشريحة. ثم قم بإزالة المصفوفة من الرقصة وحركها لمدة 15 ثانية في مخزن الغسيل الأول أ. انقل المصفوفة بسرعة إلى رف منزلق مغمور في مخزن الغسيل المخزن المؤقت واحد B وقم بتحريك رف الشرائح بقوة لمدة دقيقتين.

ثم انقل رف الشرائح إلى مخزن الغسيل الثاني وحرك لمدة دقيقة واحدة. أخيرا ، انقل رف الشرائح إلى مخزن الغسيل الثالث وحركه لمدة 15 ثانية. قم بإنهاء الغسالات عن طريق نقل المصفوفة إلى جهاز الطرد المركزي لتجفيف الشرائح وتدويرها لمدة دقيقتين بعد الطرد المركزي.

قم بمسح المصفوفة على الفور نظرا لأن D حساس للضوء والأوزون ، وابدأ المسح عن طريق تحميل الباركود الخاص بالمصفوفة لأسفل في الماسح الضوئي لمصفوفة الجينات 4 ، 000 B. في مجموعة مربع حوار إعداد الأجهزة ، يحتوي الليزر 532 نانومتر على قيمة PMT محددة على 500 ، واضبط الطاقة على حجم 100٪ بكسل إلى خمسة ميكرون ، والخطوط على المتوسط إلى واحد وموضع التركيز على صفر ميكرون. عند اكتمال الإعداد، قم بمعاينة المصفوفة.

اختر منطقة لمسحها ضوئيا ثم مسحها ضوئيا. بمجرد اكتمال المسح الضوئي ، تحقق من الرسم البياني للصورة. من الناحية المثالية ، يجب أن يكون واحد E ناقص خمسة أعداد طبيعية عند حد التشبع 65 ، 000 ، مما يعني أن ما يقرب من واحد إلى 2٪ من الميزات مشبعة.

إذا كانت الأعداد الطبيعية أقل من واحد E ناقص خمسة ، فقم بزيادة كسب PMT وأعد مسح الشريحة. إذا كانت الأعداد الطبيعية أكبر من واحد E ناقص خمسة، فقم بتقليل كسب PMT وإعادة مسح الشريحة ضوئيا، واحفظ الصورة، واستخدم برنامج تحليل البيانات لتطبيع البيانات وحساب قيم الكثافة. ينتج عن تفاعل الملصقات بشكل روتيني ما لا يقل عن 10 ميكروغرامات من CDNA المسمى.

يمكن حساب دمج الصبغة باستخدام نسبة صبغة أساسية بسيطة حيث تساوي نسبة النيوكليوتيدات إلى ثلاثة SI نسبة A اثنين 60 إلى خمسة 50 مضروبة في 23 نقطة 15. سيؤدي التفاعل الجيد إلى قيمة تتراوح بين 50 و 80. سيكون للتهجين المقبول واحد إلى 2٪ من الميزات المشبعة الغلة.

واحد E ناقص خمسة عدات طبيعية عند حد التشبع 65,000. مع مجموعة قيمة PMT ، يمكن أيضا تقييم جودة التهجين القريبة من 500 نوعيا من خلال عرض الصورة الممسوحة ضوئيا للمصفوفة الدقيقة وتقييم شدة oligos المحاذاة للميزات الأخرى على المصفوفة. يجب أيضا تقييم الصورة الممسوحة ضوئيا بحثا عن أي بقع غبار معينة داخل منطقة المصفوفة.

في التحليل اللاحق ، يمكن استخدام مخطط مبعثر لتصوير بيانات التحليل الخاصة بك لتحديد المستويات النسبية للتعبير الجيني في العينات وتحديد الجينات التي يتم التعبير عنها بشكل تفاضلي. سوف تنحرف الجينات التي يتم التعبير عنها بشكل تفاضلي بشكل كبير عن أفضل خط ملائم في إجراء مجاني. لقد أوضحنا لك كيفية استخراج الحمض النووي الريبي من أجنة الزرد في تصنيع c CD NA. لقد أوضحنا لك هنا كيفية تسمية وتهجين CD NA على منصة الأشعة الدقيقة قليلة النوكليوتيدات لدراسة ملفات تعريف التعبير الجيني العالمية.

عند القيام بهذا الإجراء ، تذكر دائما استخدام CD NA عالي الجودة وتجنب تعريض صبغة الموقع ثلاثة للإضاءة المباشرة. هذا كل شيء. شكرا لك على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.