تحليل التعبير الجيني العالمي باستخدام ميكروأري قليل النوكليوتيد منهاج اسماك الزرد

تبدأ هذه الإجراءات باستخدام cDNA تم تخليقه من قالب RNA عالي الجودة. يتم أولاً وسم cDNA بالصبغة الفلورية Cy3. وعند اكتمال تفاعل الوسم، يتم تنقية cDNA الموسوم وعزله، ثم تقييم جودة تفاعل الوسم.

يتم بعد ذلك تهجين الـ CDNA المسمى على مصفوفة ميكروية. وبعد عملية التهجين، تُحلل المصفوفات لتحديد المستويات النسبية للتعبير الجيني في العينات. مرحباً، اسمي سام بيترسون من مختبر الدكتورة جينيفر فريمان في كلية العلوم الصحية بجامعة بوردو.

لقد عرضنا لكم سابقاً كيفية استخلاص الـ RNA من أجنة سمك الزيبرا وتحويل هذا الـ RNA إلى CDNA. سنقوم اليوم بتوضيح إجراءات وسم هذا الـ CDNA وتهجينه على منصة مصفوفة دقيقة من قليلات النوكليوتيد (oligo nucleotide microarray) خاصة بسمك الزيبرا لدراسة أنماط التعبير الجيني الشاملة. وعادةً ما نستخدم هذا الإجراء لدراسة التعبير الجيني التفاضلي استجابةً للتعرض لمادة سامة.

لنبدأ الآن. تتطلب تجربة المصفوفة الدقيقة بيئة ذات إضاءة منخفضة لمنع التحلل الضوئي للصبغة الفلورية Cy3 المستخدمة في الوسم. لبدء وسم cDNA باستخدام Cy3، قم بإذابة المكونات التالية من نظام BioPrime Array CGH Genomic Labeling System: محلول random primer buffer بتركيز 2.5x، ومزيج dCTP بتركيز 10X، وماء خالٍ من النيوكلياز. بالإضافة إلى ذلك، قم بإذابة المخزون بتركيز 1 mM من dCTP الموُسم بـ Cy3. بعد الإذابة، قم بإجراء طرد مركزي قصير للمحاليل في أنبوب ذو جدران سميكة سعة 0.6 mL.

أضف 500 nanograms من CDNA و40 µL من 2.5 x random primer buffer وماءً خالياً من النوكلياز للوصول إلى حجم إجمالي قدره 86 µL. اخلط المزيج جيداً وقم بطرده مركزياً لفترة وجيزة، ثم حضّن التفاعل عند 100 °C في جهاز الدورات الحرارية لمدة خمس دقائق. وفي نهاية فترة التحضين، انقل التفاعل فوراً إلى حمام ثلجي لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، قم بإخراج إنزيم exo DNA polymerase من المجمد ووضعه على الثلج. ثم أضف إلى أنبوب التفاعل 10 µL من 10 X-D-C-T-P Mix، و2 µL من 1 mM SI 3D CTP، و2 µL من XO cleanout DNA polymerase، ثم اخلط المكونات جيداً وقم بالطرد المركزي لفترة وجيزة. وأخيراً، قم بتحضين التفاعل عند 37 °C لمدة 16 ساعة في جهاز thermocycler حتى تنتهي عملية الوسم.

ابدأ بعملية تنقية وترسيب الـ CDNA المُعلم. وللبدء في تنقية الـ CDNA المُعلم، ضع عمود MicroCon في أنبوب سعة 1.5 milliliter.

أضف 300 µL من 0.1 XSSC إلى العمود، ثم أضف تفاعل الوسم. قم بطرد مركزي للعمود عند 16,100 ×g لمدة 10 دقائق عند 4 °C. لاحظ أن السائل المار قد يظهر بلون وردي فاتح.

تخلص من السائل المار وأضف 300 microliters أخرى من 0.1 XSSE إلى العمود. ثم كرر عملية الطرد المركزي عند 16, 100 G لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة أربع degrees Celsius. تخلص مرة أخرى من السائل المار وأضف 300 microliters إضافية من T 0.1 XSSC إلى العمود، ثم قم بإجراء الطرد المركزي عند 16, 100 G لمدة 12 دقيقة عند درجة حرارة أربع degrees Celsius بعد عملية الغسل الأخيرة هذه.

يجب أن يكون السائل المار صافياً وأن يكون الـ CDNA المسمى باللون الوردي مرئياً على العمود. مرة أخرى، تخلص من السائل المار من عملية الغسل النهائية هذه لاستخلاص الـ CD NA المسمى. أضف 100 µL من الماء الخالي من النوكلياز إلى العمود. أخرج العمود من أنبوب الطرد المركزي الدقيق واقلبه في أنبوب جديد.

بعد ذلك، قم بطرد العمود المقلوب مركزياً عند 2,300 G لمدة دقيقتين عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. يذوب الـ CDNA المسمى في الماء الموجود في قاع الأنبوب. تحقق من الـ CDNA المشار إليه باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop ND 1000 وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.

احسب تركيز DNA وقيم دمج الصبغة كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المرفق. إذا كان cDNA مُعلمًا بشكل كافٍ، ضع 6 µg في أنبوب جديد لترسيب خليط cDNA المُعلم باستخدام 0.1 x حجم من أسيتات الصوديوم بتركيز 3 M عند pH 5.2 و 1 x حجم من Isopropanol، مع التحضين في الظلام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

مع مراعاة تنفيذ جميع الخطوات حتى هذه المرحلة في بيئة ذات إضاءة خافتة. بعد ذلك، يتم طرد العينة مركزياً عند 16,100 G لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وبعد عملية الطرد المركزي، يتم التخلص من السائل الطافي بعناية دون تعكير راسب الـ DNA، والذي يكون لونه وردياً.

أخيرًا، تُغسل العينات بإضافة 500 µL من الإيثانول بتركيز 70% وتُخلط عن طريق القلب اللطيف، ثم تُوضع في جهاز الطرد المركزي بسرعة 16,100 G لمدة خمس دقائق. وفي درجة حرارة الغرفة، يُزال السائل الطافي، ويُقلب الأنبوب، ويُترك الراسب ليجف لمدة خمس دقائق. وبذلك يصبح الـ CDNA المسمى جاهزًا للتهجين.

قبل البدء في عملية التهجين، قم بتشغيل نظام التهجين nimble gen واتركه حتى يصل إلى درجة حرارة توازن تبلغ 42 درجة Celsius. ابدأ بإذابة حبيبات CD NA الموسومة في خمسة microliters من الماء الخالي من النوكلياز لإذابة الحبيبات. أضف مكونات التهجين من طقم Roche Nimble Gen Hybridization، وهي منظم التهجين hybrid A وبادئ المحاذاة (alignment oligo)، ليصل الحجم الإجمالي إلى 18 microliters كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المرفق.

امزج المكونات جيداً وقم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة لترسيب المحتويات في القاع. بعد ذلك، قم بمسخ الـ CDNA المسمى بوضع الأنبوب عند 95 °C لمدة خمس دقائق. انقل الأنبوب فوراً إلى نظام التهجين nimble gen حتى تصبح المصفوفات جاهزة.

لاحظ أن المصفوفات الدقيقة تتطلب مناولة وتخزيناً دقيقين. تُخزن مصفوفات Roche nimble gen في الظلام مع وجود مادة مجففة في درجة حرارة الغرفة. قم بتحميل المصفوفة في أداة محاذاة الخلاط الدقيق.

قم بتحميل الخلاط X one في جهاز PMA T ثم أزل الشريط اللاصق باستخدام الملقط. بعد تحميل المصفوفة والخلاط، أغلق جهاز PMA T بإحكام. بعد ذلك، افصل المصفوفة والخلاط عن جهاز PMA T عن طريق الضغط على الخلاط من خلال الفتحة الموجودة في جهاز PMA t.

أخيراً، استخدم بكرة (brayer) لتسليط الضغط حول الإطار الخارجي لجهاز الخلط للتأكد من إحكام غلق المصفوفة وإزالة أي فقاعات. بعد ذلك، ضع مجمع جهاز خلط المصفوفة على نظام التهجين للتدفئة، وذلك لتحميل عينة CDNA على المصفوفة. استخدم مكبس الإزاحة ببطء ومع تسليط ضغط ثابت.

أضف 15 µL من العينة الموُسومة إلى فتحة التعبئة الموجودة في مركز الخلاط. امسح أي عينة زائدة من فتحات المنفذ وأغلقها باستخدام شرائط لاصقة، ثم أغلق المزلاج.

ابدأ الآن بخلط محلول التهجين باستخدام البرنامج B في نظام التهجين nimble gen. اترك المصفوفة الدقيقة لتتهجن لمدة تتراوح من 16 إلى 20 ساعة. بعد التهجين، سيتم غسل المصفوفة الدقيقة ومسحها ضوئياً عند اقتراب عملية التهجين من الاكتمال. استعد للمسح الضوئي عن طريق تشغيل ماسح المصفوفات gene picks 4,000 B واتركه ليسخن لمدة 15 دقيقة تقريباً.

بعد ذلك، قم بتحضير محاليل الغسل wash buffers one A وone B two وthree كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المرفق. قم بتسخين محلول الغسل wash buffer one A مسبقاً إلى 42 °C، مع ترك المحاليل الأخرى في درجة حرارة الغرفة. عندما يسخن محلول الغسل wash buffer one A، صبّه في وعاء.

اغمر حامل الشرائح في محلول غسيل واحد B. الآن، قم بإزالة مجمع خلاط المصفوفة من نظام التهجين nimble gen وضعه في القالب. ابدأ عملية الغسيل بغمر التجميعة في محلول غسيل واحد A المسخن مسبقاً، ثم قم بإزالة الخلاط بعناية عن طريق تقشيره بعيداً عن الشريحة. بعد ذلك، أخرج المصفوفة من القالب ورجّها لمدة 15 ثانية في محلول غسيل واحد A. انقل المصفوفة بسرعة إلى حامل شرائح مغمور في محلول غسيل واحد B ورجّ حامل الشرائح بقوة لمدة دقيقتين.

بعد ذلك، انقل حامل الشرائح إلى محلول الغسيل الثاني وقم برجّه لمدة دقيقة واحدة. وأخيراً، انقل حامل الشرائح إلى محلول الغسيل الثالث وقم برجّه لمدة 15 ثانية. أتمِم عملية الغسيل بنقل المصفوفة إلى جهاز طرد مركزي لتجفيف الشرائح، ثم قم بتدويره لمدة دقيقتين بعد بدء عملية الطرد المركزي.

قم بمسح المصفوفة فوراً نظراً لحساسية D للضوء والأوزون، وابدأ عملية المسح بتحميل المصفوفة بحيث يكون الرمز الشريطي متجهاً للأسفل في ماسح المصفوفات gene picks 4, 000 B. في مربع حوار إعدادات الأجهزة، اضبط قيمة PMT لليزر 532 nanometer على 500، واضبط الطاقة على 100%، وحجم البكسل على خمس microns، وعدد الخطوط التي يتم حساب متوسطها على واحد، وموضع التركيز على naught microns. عند اكتمال الإعداد، قم بمعاينة المصفوفة.

اختر منطقة لمسحها ثم قم بإجراء المسح. بمجرد اكتمال المسح، افحص المدرج التكراري للصورة. من الناحية المثالية، يجب أن تكون قيمة واحدة من العدات الطبيعية بمقدار E minus five عند حد التشبع 65,000، مما يعني أن حوالي 1 إلى 2% من المعالم قد وصلت إلى حالة التشبع.

إذا كانت التعدادات المُطبعة أقل من 1E-5، قم بزيادة كسب أنبوب المضاعف الضوئي (PMT gain) وأعد مسح الشريحة. أما إذا كانت التعدادات المُطبعة أكبر من 1E-5، فقم بتقليل كسب أنبوب المضاعف الضوئي (PMT gain) وأعد مسح الشريحة، ثم احفظ الصورة، واستخدم برنامجاً لتحليل البيانات من أجل تطبيع البيانات وحساب قيم الكثافة. وعادةً ما ينتج عن تفاعل الوسم 10 µg على الأقل من الـ CDNA الموّسم.

يمكن حساب دمج الصبغة باستخدام نسبة صبغة أساسية بسيطة حيث تساوي نسبة النيوكليوتيد إلى SI three نسبة A two 60 إلى a five 50 مضروبة في 23 point 15. سيؤدي التفاعل الجيد إلى قيمة تتراوح بين 50 و 80. أما التهجين المقبول فسيكون لديه 1 إلى 2% من الميزات المشبعة.

تعدّ قيمة 1E-5 من التعدادات المعيارية عند حد التشبع البالغ 65,000. ومع ضبط قيمة PMT عند مستوى قريب من 500، يمكن أيضاً تقييم جودة التهجين نوعياً من خلال عرض الصورة الممسوحة ضوئياً للمصفوفة الدقيقة وتقييم شدة الـ oligos المصطفة مقارنة بالميزات الأخرى في المصفوفة. كما يجب فحص الصورة الممسوحة ضوئياً للتأكد من عدم وجود أي بقع محددة أو شوائب غبار ضمن منطقة المصفوفة.

في التحليلات اللاحقة، يمكن استخدام مخطط التبعثر لتصوير البيانات التي تم تحليلها لتحديد المستويات النسبية للتعبير الجيني في العينات وتحديد الجينات ذات التعبير التفاضلي. ستنحرف الجينات ذات التعبير التفاضلي بشكل ملحوظ عن خط الملاءمة الأفضل. في إجراء تكميلي، أوضحنا لكم كيفية استخراج RNA من أجنة zebrafish وتصنيع cDNA. وهنا أوضحنا لكم كيفية وسم وتهجين cDNA على منصة مصفوفة oligonucleotide ميكروية لدراسة ملفات التعبير الجيني الشاملة.

عند إجراء هذه العملية، تذكر دائماً استخدام CD NA عالي الجودة وتجنب تعريض صبغة site three للإضاءة المباشرة. هذا كل شيء. شكراً لمشاهدتكم وحظاً موفقاً في تجاربكم.