التنميط الحمض النووي توقيت النسخ المتماثل باستخدام الزرد كنظام نموذجي في فيفو

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء خرائط توقيت تكرار الحمض النووي للجينوم الكامل من أجنة أسماك الزرد في مراحل مختلفة من التطور. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في دورة الخلية ومجالات بيولوجيا الكروماتين ، مثل كيف يمكن أن تؤثر تغيرات الكروماتين التي تحدث أثناء التطور الجنيني على بدء شوكات تكرار الحمض النووي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها ترسم خرائط لتغيرات النسخ المتماثل التي تحدث في الجسم الحي في مراحل محددة من التطور الجنيني.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة حول كيفية تغير تكرار الحمض النووي أثناء تطور أسماك الزرد ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى أو كائنات حية نموذجية ، مثل الغلالات والضفادع والذباب. بشكل عام ، قد يعاني الأشخاص الجدد في هذه الطريقة لأن الأمر يتطلب بعض الممارسة لتوليد معلقات أحادية الخلية من أجنة أسماك الزرد. في الليلة التي تسبق جمع الأجنة ، ضع العشرات من البالغين المتكاثرين في أحواض التكاثر ، باستخدام أعداد متساوية تقريبا من الذكور والإناث.

اعتمادا على التجربة ، استخدم إحدى استراتيجيات التربية التالية. بالنسبة لاستراتيجية التكاثر الأولى ، ضع عددا قليلا من ذكور وإناث أسماك الزرد في أحواض التكاثر الفردية ، واستخدم فاصلا لفصل الذكور عن الإناث. إذا تم استخدام هذا النهج ، فقم بإعداد العديد من خزانات التكاثر المختلفة وتجميع الأجنة من كل منها للتأكد من أن التباين البيولوجي يمثل السكان.

لاستراتيجية التربية رقم اثنين ، اجمع العشرات من ذكور وإناث أسماك الزرد في حوض تربية كبير. استخدم هذه الإستراتيجية طالما أن هناك عددا كبيرا بما فيه الكفاية من الأجنة. من المعقول أن نفترض أنهم جاءوا من مجموعة متنوعة من المؤسسين وبالتالي فهم يمثلون وراثيا السكان.

لإجراء التزاوج المحدد بوقت ، ابدأ بمجرد أن تبدأ دورات الضوء في الصباح. اسمح للأسماك بالتكاثر في المياه الضحلة لمدة 10 دقائق ، مع وجود قاع زائف حتى تهرب الأجنة. بعد 10 دقائق ، اجمع الأجنة عن طريق سكبها في مصفاة واستخدام زجاجة غسيل لشطفها في طبق طوله 10 سم.

قم بتجميع جميع الأجنة التي تم جمعها في نفس الوقت ، وقم بتمييزها بوقت التجميع ، وضعها على الفور في حاضنة عند 28.5 درجة مئوية. لضمان جمع الأجنة النامية بشكل متزامن ، من الأهمية بمكان جمع دفعات من الأجنة كل 10 دقائق. هذا مهم بشكل خاص مع المراحل الأولى من التطور الجنيني.

يمكن توقع مئات الأجنة من زوج تزاوج واحد في يوم واحد. اسمح للبالغين بالتكاثر في دورات مدتها 10 دقائق حتى يصبح عدد الأجنة التي تم الحصول عليها أقل من 20. بعد حوالي ساعة إلى 1.5 ساعة من الجمع ، لفرز الأجنة ، وإزالتها من الحاضنة ، ومراقبتها تحت مجهر تشريح ، وفرزها لإزالة البويضات الميتة وغير المخصبة.

عد الأجنة ، وضعها بكثافة 100 جنين لكل صفيحة 10 سم. أضف وسط E3 الطازج ، وأعد الأجنة إلى حاضنة 28.5 درجة مئوية. عندما تصل الأجنة إلى المرحلة المطلوبة من التطور ، تحقق من المرحلة شكليا تحت المجهر الضوئي وفقا لمراحل التطور الجنيني لأسماك الزرد.

إذا كان حجم الأجنة 48 حصانا أو أصغر ، فقم بنقل ما يصل إلى 1500 جنين مرحلي إلى أنبوب مخروطي 15 مليلتر واستخدم E3 لغسلها عدة مرات. لكل 100 جنين ، أضف ملليلتر واحد من E3 و 20 ميكرولتر من محلول Pronase وقم بتحريكه برفق. يمكن إزالة ما يصل إلى 1500 جنين في أنبوب واحد يحتوي على 15 مل من E3. ضع الأنبوب على جانبه ، ورتب الأجنة في طبقة متساوية لضمان أقصى نسبة من السطح إلى الحجم.

حرك الأنبوب برفق كل دقيقتين إلى ثلاث دقائق حتى تسقط جميع المشيمات من الأجنة. سيختلف إجمالي وقت التخريط اعتمادا على نشاط Pronase. قم بإزالة المادة الطافية ، وباستخدام 10 مل من E3 ، اشطف الأجنة برفق ثلاث مرات.

بعد وضع الأجنة على الجليد وإزالة E3 المتبقي ، استخدم ملليلترا واحدا من محلول إزالة الصفار المثلج المحضر حديثا لكل 500 جنين لغسل العينة. بعد ذلك ، باستخدام P1000 ، قم بسحب الأجنة برفق لأعلى ولأسفل من خمس إلى 10 مرات لتعطيل كيس الصفار. بعد ذلك ، انقل مليلتر واحد إلى أنبوب ميكرو فوج سعة 1.5 مليلتر ، وقم بالطرد المركزي للعينة عند أربع درجات مئوية و 500 مرة من الجاذبية لمدة خمس دقائق.

يجب سحب العينات بقوة كافية لإنشاء معلق أحادي الخلية دون تحلل الخلايا. ستستغرق هذه الخطوة بعض الممارسة. قم بإزالة المادة الطافية ، واستخدم ملليلترا واحدا من 1x PBS المثلج لغسل الحبيبات لإزالة محلول Ringer.

ثم ، قم بالطرد المركزي للعينة مرة أخرى. قم بإزالة المادة الطافية بعناية ، وأعد تعليق الخلايا في مليلتر واحد من 1x PBS. ثم ضع الأنبوب على الجليد.

أضف ثلاثة ملليلتر من الإيثانول المثلج إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر ، وقم بتدوير أنبوب EtOH برفق على إعداد منخفض. باستخدام P1000 ، قم بالتنقيط ببطء تعليق خلية جنين الزرد في EtOH مع الاستمرار في الدوامة. أضف ما مجموعه ملليلتر واحد من تعليق الخلية الجنينية ، للحصول على محلول تثبيت نهائي بنسبة 75٪ EtOH.

بعد إضافة مليلتر واحد من تعليق الخلية ، قم بتدوير الأنبوب برفق لخلطه وضعه على جانبه عند سالب 20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل ، أو قم بتخزين المعلق في الفريزر لمدة أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع. لتلطيخ الحمض النووي الجنيني ، بعد إزالة الخلايا الجنينية الثابتة ب EtOH من سالب 20 درجة مئوية ، قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 1500 ضعف الجاذبية وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. ضع الأنبوب على الثلج ، وقم بإزالة المادة الطافية بعناية.

بعد ذلك ، باستخدام P1000 ، قم بإعادة تعليق الخلايا برفق في ملليلتر واحد من PBS-BSA الطازج البارد. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 1500 مرة من الجاذبية وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق ، وضع العينة على الجليد. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية ، ولكل 1000 جنين ، أضف 200 ميكرولتر من محلول تلطيخ يوديد البروبيديوم وأعد تعليق الخلايا.

اسمح للخلايا بالتحتضن في محلول PI لمدة 30 دقيقة على الجليد ، مع الخلط برفق كل خمس دقائق. ضع مصفاة خلايا نايلون 40 ميكرومتر على أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر على الجليد. بعد ذلك، قم بعمل ماصة الخلايا برفق لخلط محلول الخلية وتصفيته من خلال الشبكة.

باستخدام الطرف الداخلي المسطح لمكبس الحقنة ، قم بتعطيل أي كتل متبقية من الخلايا على الشبكة برفق. لكل 1000 جنين ، استخدم 500 ميكرولتر من PBS-BSA البارد لشطف الخلايا من خلال الفلتر. ضع شبكة 40 ميكرومتر فوق أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر على الجليد ، وقم بتصفية تعليق الخلية من الأنبوب المخروطي سعة 50 مليلتر مرة ثانية في الأنبوب سعة 15 ملليلترا.

أخيرا ، باستخدام أداة فرز الخلايا المناسبة ، اضبط إثارة الليزر على 561 نانومتر وكشف الانبعاثات على 610 على 20 للكشف عن يوديد البروبيديوم. قم بفرز الخلايا وإجراء تحليلات إضافية وفقا لبروتوكول النص. لتحديد جودة تعيين القراءة ، يجب أولا محاذاة بيانات التسلسل مع الجينوم ، باستخدام إحصائيات قيم mapQ.

بالإضافة إلى ذلك ، يتم رسم إحصائيات طول القراءة المحسوبة كرسم بياني لتوزيع أحجام الإدراج لجميع قراءات التسلسل. أسفرت هذه التجربة بالذات عن متوسط 170 نقطة أساس. يوضح هذا الرسم البياني الشريطي إحصائيات القراءة لإجمالي القراءات المعينة ، والقراءات التي تحتوي على علامة منخفضة الجودة ، والقراءات مع تعيين أزواج إلى كروموسوم مختلف ، والقراءات بزوج يتجاوز عتبة المسافة ، وتكرارات PCR.

يتم سرد الأرقام التمثيلية لإجمالي القراءات والتغطية ودقة القراءة المعينة وغير المعينة وغير المزدوجة لتشغيل التسلسل النموذجي لعينة من سمك الزرد هنا. بعد التصفية ، يتم تحديد عدد القراءة في نوافذ متغيرة الحجم ويتم تنعيم البيانات وتطبيعها. يتم هنا عرض ملفات تعريف توقيت النسخ المتماثل الممهد والطبيعي لكروموسوم الزرد التمثيلي للتكرارات البيولوجية.

يجب أن تكون ملفات تعريف التكرارات البيولوجية والتجريبية متشابهة جدا وأن تعرض أيضا ارتباطا عاليا على طول الكروموسوم. يجب أن تعرض الملفات الشخصية أيضا ارتباطا عاليا بين قيم التوقيت على مستوى الجينوم. تمثل خريطة الألوان معامل ارتباط بيرسون.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم للغاية أن تتذكر التأكد من جمع الأجنة النامية بشكل متزامن. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل حقن المورفولينو أو طفرات CRISPR-Cas9 ، من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل ما هي الآليات التي يتم من خلالها تنسيق تكرار الحمض النووي مع العمليات التنموية الأخرى؟ بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية جمع الخلايا في مراحل محددة من دورة الخلية من أجنة الزرد النامية بشكل متزامن.

يعد جمع هذه العينات أمرا بالغ الأهمية لإنشاء خرائط توقيت تكرار الحمض النووي للجينوم الكامل.