التحديد الكمي "المعلومات المشفرة" واسطة الجينات التعبير مستويات خلال عمر التحوير تحت نطاق واسع "الغذائية التقييد" في C. ايليجانس

الهدف العام لهذا الإطار هو تحديد الجينات المشاركة في تقييد النظام الغذائي واسع النطاق ، وتحديد المعلومات البيئية المشفرة بمستويات التعبير الخاصة بها وفهم استراتيجية الترميز الأساسية التي تربط البيئة بالعمر الافتراضي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا العصبية للشيخوخة ، مثل الجينات التي تنقل المعلومات من البيئة لتعديل العمر. على الرغم من أن هذا الإطار يمكن أن يوفر نظرة ثاقبة للنظام الحسي C Elegan ، إلا أنه يمكن أيضا تطبيقه بشكل عام على أي نظام بيولوجي تتعاون مكوناته ، لمعالجة المعلومات البيئية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تحدد المعلومات البيئية المشفرة بواسطة مجموعات من الخلايا العصبية وتحدد استراتيجية الترميز التي تستخدمها الخلايا العصبية لنقل هذه المعلومات إلى أهداف المصب. بعد زراعة OP50 على ألواح MGM وفقا لبروتوكول النص ، قم بإعداد 500 مل من وسط LB في كل من قوارير إرلينماير سعة لترين وقم بالتعقيم فيها. قم بتلقيح كل قارورة بمستعمرة واحدة من OP50 وقم بزراعة المزارع عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة لمدة 14 ساعة تقريبا.

بعد ذلك ، استكمل الثقافات ب 50 ميكروغرام لكل مليلتر من الستربتومايسين. ثم رج القوارير لمدة 30 دقيقة إضافية عند 37 درجة مئوية ، قبل وضع القوارير على الجليد لمدة 15 دقيقة. انقل 450 مل من كل مزرعة إلى زجاجات منفصلة من أجهزة الطرد المركزي المعقمة سعة 500 مل ، واحتفظ بالثقافة المتبقية على الجليد ، حيث سيتم استخدامها لتحديد تركيز البكتيريا.

قم بتدوير الزجاجات عند 4500 درجة مئوية وأربع درجات مئوية لمدة 25 دقيقة ، ثم تخلص من المادة الطافية وقم بتخزين الزجاجات على الثلج. مع 900 ميكرولتر من LB المعقم ، قم بتخفيف 100 ميكرولتر من بقايا الثقافة من كل قارورة. استخدم ملليلترا واحدا من LB المعقم لصفر مقياس الطيف الضوئي ثم حدد OD600 من التخفيف 10 أضعاف لكل ثقافة.

على سبيل المثال، إذا كان OD600 من التخفيف بمقدار 10 أضعاف للاستزراع الليلي يساوي 0.28، فإن المزرعة كان لها OD600 فعلي قدره 2.8. من هذا المثال ، للوصول إلى محلول مخزون عامل من 1.12 × 10 إلى 10 خلايا OP50 لكل مليلتر ، وهو ما يساوي OD600 من 56 ، أعد تعليق الحبيبات من 450 مليلتر في واحد من 20 من الحجم الأصلي أو 22.5 مل من المحلول القاعدي المعقم S أو SB ، مكملا ب 50 ميكروغرام لكل مليلتر من الستربتومايسين. قم بعمل جميع التركيزات اللاحقة المستخدمة في التجارب في SB و Strep ، من التخفيفات التسلسلية لمخزون العمل ، باستخدام عوامل التخفيف المدرجة في هذا الجدول.

بعد زراعة ومزامنة سلالات مراسل C Elegans وفقا لبروتوكول النص ، استخدم 15 مل من SB لغسل الديدان بشكل متسلسل من الألواح الثلاثة وجمع السائل في أنبوب معقم سعة 15 مل. اسمح ليرقات L4 بالترسيب بشكل طبيعي ثم استنشق كل السائل باستثناء حوالي 0.5 مل. في سلالات المراسل من النوع البري ، يزيل هذا النوع أي يرقات أصغر من L4.In خلفيات متحولة ، وتساعد هذه الخطوة في إزالة أي يرقات تم القبض عليها ، مثل يرقاتنا ، في حالة وفاة OK3125.

بعد ذلك ، استخدم تسعة ملليلتر من SB لإعادة تعليق الديدان. مرة أخرى ، راقب معدل ترسيب يرقات L4 ثم استنشق كل ما عدا حوالي 0.5 مل من المادة الطافية بمجرد أن يتم تكوير معظم يرقات L4 قبل تكرار العملية. أضف 10 ميكرولتر من الوسط القاعدي المعقم S ، مع 0.1٪ pluronic F127 إلى السائل الذي يحتوي على يرقات L4.

يعمل هذا كمادة خافضة للتوتر السطحي ويمنع اليرقات من الالتصاق بالسطح الداخلي لأطراف الماصة البلاستيكية. باستخدام طرف ماصة P200 منخفض الاحتجاز ، أعد تعليق اليرقات برفق ، ثم قم بنقل 150 ميكرولترا على ثلاث ألواح RNAi مقاس 10 سم يتم زرعها ب 5 × 225 ميكرولتر من بكتيريا RNAi الخمسة للبيض. تأكد من توزيع الديدان بالتساوي عبر جميع مروج البكتيريا الخمسة.

بمجرد امتصاص السائل في الأجار ، قم بإزالة أي يرقات غير L4 من الألواح التي لم يتم التخلص منها بواسطة إجراء الغسيل ، عن طريق التقاطها يدويا. ثم قم بتخزين الأطباق على حرارة 20 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. لبدء DR واسع النطاق ، التقط أي يرقات صغيرة هربت من خطوة الإزالة اليدوية السابقة ، تاركة فقط البالغين الذين يبلغون من العمر يوما واحدا على الأطباق.

لكل سلالة ، استخدم 15 مل من البكتيريا العقدية SB المعقمة ، لغسل البالغين البالغين بعمر يوم واحد من الأطباق الثلاثة ، في أنبوب سعة 15 ملليلترا. اسمح للديدان بالترسيب بشكل طبيعي ثم استنشق كل المادة الطافية باستثناء 0.5 مل. أعد تعليق الديدان ب 9.5 مل من البكتيريا العقدية SB وكرر خطوات الترسيب والغسيل.

بعد الغسيل النهائي وشفط جميع المواد الطافية باستثناء 0.5 مل، أضف 10 ميكرولترات من SB Plu واستخدم طرف ماصة P200 لإعادة تعليق اليرقات برفق. Aliquot 100 ميكرولتر من اليرقات على صفيحة NSC ، بذرة 5 × 225 ميكرولتر من البكتيريا ، بتركيز 2 × 10 إلى الخلايا التاسعة لكل مليلتر. وزعي 100 ميكرولتر بالتساوي على جميع مروج البكتيريا الخمسة.

تحت المجهر ، قم بتقدير عدد الموجودة على اللوحة ، بهدف ما بين 100 و 150 دودة لكل طبقة. حدد حجم السائل المطلوب لتحقيق كثافة دودة ضمن هذا النطاق ثم قم بتقسيسه على لوحين إضافيين. اضبط عدد الديدان على اللوحة الأولى لتقع أيضا في هذا النطاق.

ثم قم بتخزين الأطباق على حرارة 20 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، اجمع البالغين البالغين الذين يبلغون من العمر يومين ووزع الديدان على أطباق NSC جديدة مع الرغبة في التركيز التجريبي للطعام. بمجرد امتصاص السائل في الأجار ، قم بتحويل الألواح إلى درجة الحرارة التجريبية المطلوبة لمدة 24 ساعة.

في اليوم التالي ، اجمع البالغين البالغين الذين يبلغون من العمر ثلاثة أيام ووزعهم على أطباق NSC الطازجة ، المصنفة بنفس التركيز التجريبي للطعام. بمجرد امتصاص السائل في الأجار ، أعد الألواح إلى درجة الحرارة التجريبية لمدة 48 ساعة. أخيرا ، استخدم جهاز الموائع الدقيقة لتصوير قبل تجميع البيانات وتحديدها وفقا لبروتوكول النص.

كما هو موضح هنا ، فإن متوسط العمر الافتراضي لسلالة النوع n2 البرية ، يعرض استجابة معقدة لنطاق واسع DR. يتم تخفيف حجم هذه الاستجابة في طفرة كاملة من جين daf-7 ، مما يشير إلى أن هذا الجين يؤثر على قدرة الدودة على الاستجابة بشكل صحيح للتغيرات في وفرة الطعام. يعرض متوسط مستويات التعبير لمراسل النسخ لجين daf-7 وخلفية النوع البري أيضا استجابة معقدة غير رتيبة لنطاق واسع DR.In daf-7 (الخلفية الجينية ، والتعبير عن هذا المراسل النسخي ضعيف للغاية ويظهر استجابة قليلة للتغيرات في مستوى الطعام. يوضح هذا الشكل تقدير التوزيع المشترك لتعبير TPH1 في الخلايا العصبية ADF وتعبير daf-7 في الخلايا العصبية ASI لمستوى غذائي معين.

تقدم هذه الرسوم البيانية الشريطية معلومات الطعام المشفرة ، إما بشكل مجتمعي أو فردي ، بواسطة الخلايا العصبية ADF و ASI و NSM ، بناء على مستويات التعبير الجيني ل TPH1 و daf-7. الأحرف الزائدة عن الحاجة والتآزر للترميز ، تنتج عن المقارنة بين المعلومات الاندماجية والفردية المشفرة بواسطة الخلايا العصبية التي يمثلها الاختلاف في ارتفاع الأشرطة المكدسة على اليمين والمعلومات المشفرة بواسطة الدائرة الكاملة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن نتذكر أن تكرار نظرية المعلومات لتحديد استراتيجية الترميز يتطلب تقديرا دقيقا لتوزيعات التعبير الجيني.

لهذا السبب ، يعد حجم العينة عاملا حاسما للتطبيق العام لهذا الإطار. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تجارب تقييد غذائية واسعة النطاق لتحديد وتوصيف الجينات الجديدة التي تربط وفرة الطعام بالعمر الافتراضي.