تقييم آثار المركبات على تطوير شبكات عصبونية الفقاريات دالة باستخدام صفائف متعدد القطب الصماء

الهدف العام من هذا البروتوكول التجريبي هو اختبار تأثيرات المركبات المسببة لاضطراب الغدد الصماء ، مثل بيسفينول ، على نشاط تصاعد الشبكة للشبكات العصبية الفقارية التي تم إنشاؤها على مصفوفات متعددة الأقطاب الكهربائية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الأعصاب التنموي وعلم السموم البيئية مثل آلية عمل السموم البيئية على تطور نشاط الشبكة في الدماغ الجنيني. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن الآن دراسة التأثيرات على معلمات الشبكة العصبية ، مثل متوسط معدل إطلاق النار ، والعدد الإجمالي للمسامير وسعة السنبلة بالإضافة إلى التزامن.

أظهرت دراستنا السابقة أن EDCs تؤثر على الكلمة والسلوك وهو ناتج مباشر للشبكات العصبية ، ويهدف بروتوكولنا الآن إلى فهم تأثير EDCs على هذه الشبكات. في يوم طلاء الخلايا العصبية ، قم بإزالة قارورة من المصفوفة خارج الخلية من الفريزر سالب 20 درجة مئوية ، ورشها بنسبة 70٪ من الإيثانول وضعها على الثلج. تأكد من إذابة المصفوفة خارج الخلية على الجليد.

لا تذوب في درجة حرارة الغرفة حيث يتبلمر ECM فوق الصفر درجة مئوية. اعمل في غطاء محرك BSL2 لتخفيف المصفوفة خارج الخلية إلى 25٪ عن طريق إضافة 300 ميكرولتر من الوسط العصبي القاعدي البارد إلى 100 ميكرولتر. بعد ذلك، استخدم ماصة P200 لإضافة 100 ميكرولتر من محلول مصفوفة خارج الخلية بنسبة 25٪ إلى مركز المصفوفة متعددة الأقطاب الكهربائية مع الحرص على عدم لمس الأقطاب الكهربائية.

قم بإزالة ECM على الفور مع ترك طبقة رقيقة على السطح. قم بتغطية المصفوفة متعددة الأقطاب الكهربائية وضعها في حاضنة زراعة الأنسجة حتى تصبح جاهزة لصفيحة الخلايا العصبية. ابدأ عزل الخلايا العصبية للكتكوت عن طريق تعقيم القشرة الخارجية لبيضة E7 بنسبة 70٪ من الإيثانول.

من المهم الحفاظ على ظروف معقمة من هذه النقطة فصاعدا. تأكد من تعقيم جميع الأدوات بنسبة 70٪ من الإيثانول وأن المحاليل معقمة. من المفيد استخدام غطاء التشريح ، لكنه ليس ضروريا تماما للتشريح إذا تم إجراؤه بسرعة.

ثم بعد استرجاع الجنين وقطع رأسه ، قم بقص العينين وإزالة مقل العيون. بعد ذلك ، استخدم ملقط دومون رقم خمسة ومقص زنبركي لعمل شق على الجانب البطني وإزالة الطبقات الخارجية من الجلد لفضح الدماغ الأمامي والتكتوم البصري. قشر وإزالة غشاء التقشير بعناية.

انقل الدماغ الأمامي إلى طبق بتري آخر يحتوي على HBSS وقم بتقطيعه إلى قطع صغيرة يبلغ طولها حوالي ملليمترين باستخدام مقص زنبركي. استخدم ماصة نقل معقمة لنقل قطع الدماغ الأمامي إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلترا. بعد أن تغرق قطع الدماغ الأمامي في قاع أنبوب الطرد المركزي ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من HBSS.

بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من 0.5٪ تريبسين EDTA المسخن مسبقا واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. استخدم ماصة باستور لإزالة التربسين بعناية دون إزعاج قطع الأنسجة. أضف ملليلترا واحدا من الوسط العصبي القاعدي واترك قطع الأنسجة تغرق في الأسفل.

بعد إزالة الوسط وتكرار الغسيل ، أضف ملليلترين من الوسط العصبي القاعدي وقم بترتيتوريه برفق حتى لا ترى المزيد من قطع الأنسجة. تمييع الخلايا المعلقة من واحد إلى 10 مع الوسط العصبي القاعدي. عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام صبغة التريبان الزرقاء ومقياس كثافة الدم.

بعد العد ، قم بلوحة الخلايا المنفصلة على مصفوفات متعددة الأقطاب الكهربائية المطلية ب ECM بكثافة 2 ، 200 خلية لكل ملليمتر مربع. في اليوم التالي ، أضف 10 ميكرومولار BPA في الوسط العصبي القاعدي إلى المصفوفات المعالجة متعددة الأقطاب الكهربائية. في يوم الاستحواذ ، استبدل وسط الاستزراع بوسط عصبي قاعدي جديد وأعد المصفوفات إلى حاضنة CO2 لمدة ساعتين على الأقل قبل التسجيل.

ابدأ تشغيل برنامج التسجيل واضبط درجة حرارة المصفوفة متعددة الأقطاب الكهربائية على 37 درجة مئوية من خلال النقر على أيقونة درجة الحرارة. قم بتعيين معلمات الاستحواذ عن طريق تحديد التدفقات في لوحة النافذة اليسرى والنقر بزر الماوس الأيمن على أيقونة الملهمة. ثم حدد إضافة معالجة وكاشف سبايك وانقر فوق "موافق" في النافذة المنبثقة.

سيظهر كاشف سبايك ستة بواسطة STD أسفل اسم الملف. بعد ذلك ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق كاشف السنبلة ، وحدد إضافة كاشف المعالجة والانفجار وانقر فوق موافق في النافذة المنبثقة. سيظهر كاشف الاندفاع ISI أسفل أيقونة الملهمة.

ثم ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق كاشف الاندفاع ، وحدد إضافة مترجم المعالجة والإحصاءات العصبية. في النافذة المنبثقة، تأكد من تحديد رأس الملف وإحصائيات البئر المجمعة والمزامنة، انقر فوق موافق. سيظهر مترجم الإحصائيات أدناه. انقر على أيقونة الساعة في أسفل الشاشة وقم بتغيير المعلومات في قسم الإعدادات للتسجيل كل 5.1 دقيقة والتسجيل لمدة خمس دقائق.

سيبدأ هذا على الفور وسيتم تنفيذه مرة واحدة. بعد استرداد المصفوفة متعددة الأقطاب الكهربائية من الحاضنة ، ضعها على وحدة التسجيل وثبتها في مكانها. ابدأ في تسجيل نشاط الشبكة بالنقر فوق بدء التسجيل في قسم التسجيل المجدول.

عادة ما يكون وقت التسجيل البالغ خمس دقائق كافيا ، على الرغم من أنه يمكن الحصول على تسجيلات أطول تصل إلى 10 دقائق. بعد التسجيل ، أعد المصفوفة متعددة الأقطاب الكهربائية إلى الحاضنة. متوسط عدد المسامير أقل بكثير في مزارع الدماغ الأمامي للكتكوت E7 المعالجة ب BPA عند مقارنتها بثقافات التحكم.

متوسط مؤشر التزامن أقل بكثير في مزارع الدماغ الأمامي للكتكوت E7 المعالجة ب BPA عند مقارنته بثقافات التحكم. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في أقل من ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على ظروف معقمة في جميع الأوقات حتى أثناء تسجيل نشاط الارتفاع.

بعد هذا الإجراء ، يمكن تقييم تأثير الأدوية المحتملة ، مثل مضادات الصرع ومضادات الاكتئاب ، على نشاط الشبكة كخطوة نحو فهم آلية عملها. العديد من EDCs لها تأثيرات خفية على الدماغ أثناء التطور والتي تظهر على أنها تغييرات في السلوك. السلوك هو إخراج مباشر لنشاط الشبكة الأساسي.

يهدف بروتوكولنا إلى تشريح تأثيرات هذه المركبات على نشاط الشبكة.