زيادة تعتمد على الوقت في استجابة الشبكة لتحفيز الثقافات خلية الخلايا العصبية على صفائف الدقيقة الكهربائي

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل وربط الأنسجة العصبية للفئران في اليوم الجنيني E17، وذلك من أجل زراعة الشبكات العصبية وتسجيل نشاطها وتحفيزها على مصفوفات الأقطاب الكهربائية الدقيقة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في دراسة ديناميكيات الشبكة، فيما يتعلق بالآليات الأساسية للتعلم والذاكرة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في قدرة مصفوفات الأقطاب الكهربائية الدقيقة على التسجيل من مواقع متعددة في آن واحد، وبالتالي يمكنها تقديم دقة مكانية وزمنية أفضل، مقارنة بطريقة التسجيل التقليدية باستخدام الماصة الزجاجية في موقع واحد.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية حول ديناميكيات الشبكة للتعلم والذاكرة، إلا أنه يمكن استخدامها أيضاً لاستقصاء سميّة الأدوية أو تصميم نماذج للجيل القادم من الطب الشخصي. ويعد العرض المرئي لهذه العملية أمراً بالغ الأهمية، حيث يصعب تعلم كيفية التعامل مع الأنسجة أثناء عملية التشريح والتفكيك من خلال قراءة البروتوكولات وحدها. لتحضير المصفوفة، أضف من 40 إلى 50 µL من الـ laminin المذاب إلى مركز كل MEA، و 0.2 mL من الـ laminin إلى أطباق التحكم، باستخدام رؤوس ماصات معقمة.

قم بتغطية جميع مصفوفات الأقطاب الكهربائية الدقيقة (MEAs) وأطباق التحكم الموجودة في كابينة السلامة البيولوجية، وانقلها إلى حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد مرور ساعة، قم بإزالة فائض اللامينين بعناية من مركز الـ MEAs باستخدام الشفط بواسطة ماصات باستير معقمة، واترك السطح ليجف بالهواء قبل عملية الزرع. بعد ذلك، صب وسط L-15 في أربعة أطباق بتري بقطر 100 مليمتر، وقم بتغطيتها، وضعها في مجمد عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تتراوح بين 40 إلى 60 دقيقة تقريبًا، حتى يكتسب الوسط قوامًا شبه متجمد (slushy)، ولكن دون أن يتجمد تمامًا.

للتحضير لعملية التشريح، ضع طبق بتري زجاجي مقلوباً في صينية مليئة بالثلج. الآن، قم برش أسفل بطن الحيوان بـ 70% ethanol. وباستخدام مقص جراحي صغير، قم بإجراء قطع على شكل حرف V عبر الجلد والدهون تحت الجلد في أسفل البطن، مع تمديد القطع إلى النهايات القاصية للتجويف الصدري، وذلك للكشف عن الرحم.

باستخدام الملاقط، ارفع الرحم بعناية من بين الأجنة. قم بقص النسيج الضام باستخدام مقص التشريح حتى يتم تحرير الرحم بالكامل. بعد ذلك، اشطف الرحم لفترة وجيزة بـ 70% ethanol لإزالة أي دم، ثم ضعه في أحد أطباق Petri الأربعة المملوءة بـ L-15 البارد.

بعد ذلك، قم بتحرير كل جنين من الرحم ومن الكيس الجنيني الداخلي، باستخدام زوجين من الملاقط دقيقة الطرف. ضع الأجنة المحررة في الطبق الثاني المليء بوسط L-15 البارد، ثم انقل الرؤوس إلى طبق بتري الثالث، والأجسام إلى الطبق الرابع. داخل كابينة السلامة البيولوجية، ضع قطعة من ورق الترشيح المعقم بجهاز الأوتوكلاف على منصة طبق بتري الزجاجي المبرد، ثم ضع رأس جنين واحد على ورق الترشيح.

ضع بعد ذلك الحافة القاطعة للجزء السفلي من مقص القزحية في قاعدة الجمجمة، مع إبقاء الجزء السفلي ملاصقاً للسطح الداخلي للجمجمة وبعيداً عن الدماغ، ثم اقطع عبر الصفيحة القفوية وبعد ذلك على طول الخط الناصف بين الصفائح الجدارية. استمر في القطع في الاتجاه المنقاري بين الصفائح الغضروفية للجمجمة الجبهية. ثم، بدءاً من مركز الصفيحة القفوية، قم بإجراء قطع عمودي إلى يسار ويمين القطع المركزي.

بعد ذلك، مرر ملعقة مسطحة صغيرة بعناية بين السطح البطني للدماغ والصفائح السفلية للجمجمة، حتى تصبح أسفل الدماغ تماماً. ثم ارفع الملعقة المسطحة لإخراج الدماغ. وباستخدام ملعقة مسطحة نظيفة، قم أولاً بإزالة البصلة الشمية، ثم قم بتشريح الفص الجبهي بنمط شبه منحرف.

بعد ذلك، انقل النسيج إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 milliliter يحتوي على وسط تخزين. في هذا الإجراء، استخدم شفرتي مشرط معقمتين لفرم النسيج. ثم أضف 2.5 milliliters من خليط Dnase papain إلى النسيج المفروم في طبق بتري.

قم بتدوير طبق بتري بلطف للتأكد من أن جميع الأنسجة حرة في المحلول وغير ملتصقة بقاع الطبق. بعد ذلك، ضع الطبق في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. وفي خزانة السلامة البيولوجية، استخدم ماصة نقل معقمة ذات فتحة واسعة لنقل جميع الأوساط والأنسجة إلى أنبوب تجميد معقم سعة خمسة ملليلتر.

ضع طرف ماصة النقل نفسها بالقرب من قاع الأنبوب، وقم بعملية التشيريت (chiterate) للمزيج بلطف من 10 إلى 15 مرة. بعد ذلك، أضف 2 mL من وسط DMEM 5/5 الدافئ إلى مزيج الخلايا المفككة، ثم أغلق أنبوب الطرد المركزي بالغطاء. اخلط المزيج بلطف عن طريق القلب، ثم قم بطرده مركزياً عند 573 ×g لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

داخل كابينة السلامة البيولوجية، تخلص من جميع الرواسب الطافية دون تحريك الراسب الخلوي. بعد ذلك، أضف 1 mL من وسط DMEM 5/5 الدافئ إلى الراسب في الأنبوب لإعادة تعليق الخلايا. استخدم ماصة نقل معقمة ذات فتحة صغيرة لتفتيت الراسب عن طريق السحب والدفع بلطف حتى يصبح المزيج متجانساً.

بعد ذلك، انقل 10 µL من معلق الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي صغير. خارج غطاء السلامة البيولوجية، أضف 10 µL من صبغة trypan blue إلى 10 µL من معلق الخلايا الموجود في أنبوب الطرد المركزي الصغير. ثم قم بتحميل 10 µL من معلق الخلايا المصبوغ بـ trypan blue على شريحة مقياس كرات الدم (hemocytometer) مخصصة للاستخدام لمرة واحدة من أجل عد الخلايا.

داخل كابينة السلامة البيولوجية، استخدم ماصة دقيقة معقمة لنقل 50 µL من معلق الخلايا إلى مركز كل مصفوفة، وإلى كل طبق بتري ضابط. بعد ذلك، ضع أطباق بتري المغطاة في حاضنة مضبوطة على 37 °C لمدة تتراوح من ثلاث إلى أربع ساعات. ثم أضف بلطف 1 mL من وسط DMEM 5/5 الدافئ إلى كل MEA.

أضف الوسط الغذائي بعناية قطرة تلو الأخرى حول الحواف الداخلية لـ MEA، وتجنب جرف الخلايا بعيداً عن مركز المصفوفة. بعد ذلك، ضع غطاءً يحتوي على غشاء FEP نفاذ للغازات على كل MEA قبل إعادتها إلى الحاضنة. بعد يومين، قم باستبدال كامل للوسط الغذائي باستخدام DMEM+ دافئ عن طريق سحب الوسط من الطبق.

ضع طرف الماصة بعناية على الجدار الداخلي، ثم وزع 1 mL من DMEM+ الدافئ. بالنسبة لعمليات التغذية اللاحقة، اسحب 500 µL من الوسط من الطبق، ووزع 500 µL من DMEM+ الدافئ مرة أخرى. في هذا الإجراء، افحص عينات الأطباق كل يومين تحت المجهر، للتحقق من تغطية الخلايا للمصفوفة، والتأكد من عدم وجود تلوث بكتيري أو فطري. قبل إخراج المزارع من الحاضنة، قم بتوصيل وحدة التحكم في درجة الحرارة، وقم بتشغيل النظام، مع السماح للقاعدة الساخنة للمضخم الأولي بالوصول إلى 35 °C.

بعد ذلك، ضع المزرعة المغطاة في المضخم الأولي، بحيث يتماشى الخط الأسود في بئر مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة (MEA) مع الأرضي المرجعي. تأكد من محاذاة دبابيس المضخم الأولي بحيث يتم تثبيت الجزء العلوي من المضخم الأولي مع بقاء غطاء المزرعة في مكانه. بعد ذلك، اضغط على "بدء" (start) في بيئة البرنامج لبدء تصور الإشارات.

في النافذة الرئيسية، اختر Spikes، ثم Detection، ثم Automatic، وقم بتغيير قيمة الانحراف المعياري إلى سالب خمسة، وانقر فوق Refresh لإعادة تعيين العتبة. بعد تصور الإشارات، انقر فوق Stop، ثم Record، ثم Play لبدء تسجيل النشاط. يتم زرع عصبونات جنين الفأر على MEAs ذات 60 قناة، والتي تتيح التسجيل المتزامن للنشاط العصبي عبر الشبكة من كل قطب كهربائي.

يوضح هذا الشكل مخطط راستر تمثيلي للنشاط من ثمانية أقطاب كهربائية استجابةً للتحفيز قبل التدريب وبعده. يشير الخط الأحمر الرأسي إلى وقت التحفيز، بينما تشير علامات التدريج السوداء إلى جهود الفعل. وفي مرحلة ما قبل التدريب، تظهر استجابة فورية لنبضة التحفيز عبر جميع القنوات.

في مرحلة ما بعد التدريب، تظهر الشبكة استجابة نشاط أكثر طولاً، بالإضافة إلى الاستجابة الفورية للتحفيز. يظهر هنا متوسط 12 شبكة مدربة و10 شبكات ضابطة، وتشير الشبكات المدربة إلى ترددات نبضية متغيرة بشكل ملحوظ. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل وربط الأنسجة العصبية من أجنة الفئران، وأن تكون قادراً على زراعة وتسجيل وتحفيز الشبكات العصبية باستخدام مصفوفات الأقطاب الكهربائية الدقيقة.