نمذجة عدوى فيروس زكى من وضع الدماغ البشري في المختبر باستخدام الخلايا الجذعية المشتقة من أورجانويدس الدماغي

الهدف العام من هذا الإجراء هو نمذجة عدوى فيروس زيكا في الدماغ البشري النامي باستخدام العضيات الدماغية المشتقة من الخلايا الجذعية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء مثل الخلايا التي يمكن أن تصاب بالعدوى والبروتينات التي تشارك في مسار العدوى. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها تحاكي العدوى البشرية المبكرة ، ويمكن استخدامها في فحوصات عالية الإنتاجية ويمكن دمجها مع التقنيات الجينية المركزة مثل كريسبر.

يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة حول آلية العدوى بفيروس زيكا. يمكن أيضا تطبيقه على أنظمة أخرى مثل شاشات الأدوية والتنميط الزائف للفيروسات. باستخدام طرق صيانة الخلايا الجذعية المنتظمة ، اجعل المزارع بين 50٪ و 70٪ ملتقية.

افحص الثقافات باستخدام الفحص المجهري للمجال الساطع بتكبير من 10 إلى 20 ضعفا وتأكد من أن المستعمرة لديها مورفولوجيا صحية بدون تمايز يمكن اكتشافه. قم بإحضار وسائط صيانة الخلايا الجذعية الخالية من xeno إلى 37 درجة مئوية في حمام ماء ساخن وقم بإذابة ملليلترين من كاشف الانفصال الأنزيمي وقارورة سعة 50 ميكرولتر من مثبط الصخور في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بإعداد لوحة بئر U السفلية 96 منخفضة للغاية وماصة p200 متعددة القنوات وخزان كاشف سعة 25 ملليلتر.

بعد ذلك ، قم بنقل 45 مل من الوسائط في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. أضف 45 ميكرولترا من مثبط الصخور واخلطها في المثبط جيدا عن طريق ثلاثية الخليط ، متبوعا باثنين إلى أربعة في الإصدارات. قم بشفط بئرين من ستة آبار تحتوي على خلايا جذعية وأضف بسرعة ملليلترا واحدا من كاشف الانفصال الخالي من الإنزيم إلى كل بئر ، ثم احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة أربع دقائق.

بعد ذلك ، قم بشفط الآبار المعالجة بالفراغ وأضف ملليلترا واحدا من كاشف الانفصال الأنزيمي إلى كل بئر. بعد حضانة لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة. اضغط برفق على اللوحة لتفتيت أي خلايا مجمعة.

بعد ذلك ، افحص الخلايا تحت المجهر. إذا كانت مجموعات الخلايا الكبيرة لا تزال مرئية ، فقم باحتضان اللوحة لمدة دقيقتين إضافيتين عند 37 درجة مئوية. كرر الخطوة حتى تختفي العناقيد بالعين المجردة.

بمجرد تفكك الخلايا بشكل صحيح ، أضف ملليلترا واحدا من وسائط صيانة الخلايا الجذعية الخالية من xeno إلى كل بئر ، لتعطيل إنزيمات التفكك. اسحب معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر وخذ كمية صغيرة لعد الخلايا. أثناء الطرد المركزي ، عد الخلايا وحدد حجم إعادة التعليق اللازم لتحقيق 60،000 خلية لكل تعليق مليلتر.

قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الخلايا عند 60،000 خلية لكل مليلتر في الوسائط التي تحتوي على مثبط الصخور. باستخدام ماصة سعة خمسة ملليلتر، امزج الخلايا برفق من خمس إلى 10 مرات لضمان تعليق خلوي موحد. أضف تعليق الخلية على الفور إلى خزان الكاشف واستخدم ماصة p200 متعددة القنوات لنقل 150 ميكرولترا إلى كل بئر من ملحق منخفض للغاية في أسفل لوحة البئر 96.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للوحة عند 150 × جم لمدة دقيقة واحدة ثم ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية. لا تزعج اللوحة لمدة 48 ساعة. بدءا من اليوم الثاني ، قم بإعداد 17 مل من الوسائط التي تحتوي على 17 ميكرولترا من مثبط صخور المخزون في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.

سخني الخليط إلى 37 درجة مئوية في حمام ماء ساخن. خذ الصفيحة العضوية من الحاضنة وباستخدام ماصة p200 متعددة القنوات ، اسحب ببطء 75 ميكرولترا من الوسط من حواف الآبار في الصف الأول. بعد ذلك ، قم بطرده بسرعة مرة أخرى في البئر لرفع الخلايا السائبة والعضيات.

كرر عملية التشتت هذه لكل صف. انتظر لمدة 15 ثانية للتأكد من أن العضيات قد غرقت في قاع كل بئر ثم قم بشفط 75 ميكرولترا من الوسط ببطء وبعناية من كل بئر باستخدام ماصة p200 متعددة القنوات وقم بتوزيعها في خزان النفايات. بعد ذلك ، قم بنقل الوسائط التي تحتوي على مثبط الصخور إلى خزان كاشف ، وقم بتوزيع 150 ميكرولتر من الوسائط في كل بئر عضوي ثم احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية.

قم بتسخين 17 مل من الثقافة الطازجة المتوسطة إلى 37 درجة مئوية ، هذه المرة بدون أي مثبط للصخور. باستخدام ماصة p200 متعددة القنوات مضبوطة على 100 ميكرولتر، كرر عملية التشتت الموضحة سابقا وانتظر 15 ثانية للتأكد من أن العضيات قد غرقت في قاع آبارها. بعد ذلك ، قم بشفط 125 ميكرولترا من الوسط بعناية من كل بئر واستبدلها ب 150 ميكرولتر من الوسائط الدافئة.

ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية. قم بإعداد الوسيط وفقا للوصفة الموضحة هنا ثم قم بتصفية المحلول المختلط المعقم في مرشح سعة 500 مل. من اليوم الرابع حتى تصاب الخلايا في حوالي اليوم 24 ، قم بإجراء صيانة دورية كل يومين باستخدام وسيط الحث العصبي.

بمجرد التصفية ، قم بتسخين 17 مل من وسط الحث العصبي إلى 37 درجة مئوية وقم بتخزين الباقي عند أربع درجات مئوية. باستخدام ماصة p200 متعددة القنوات، مضبوطة على 100 ميكرولتر، قم بتفريق جميع آبار الصفيحة العضوية التي تم عرضها سابقا. انتظر 15 ثانية للتأكد من أن العضيات قد غرقت في قاع آبارها.

استنشق بعناية 125 ميكرولتر من الوسط من كل بئر واستبدلها ب 125 ميكرولتر من وسط الحث العصبي الجديد. كرر هذا العمل الفذ التحريضي العصبي كل يومين حتى تصبح العضيات جاهزة للعدوى بفيروس زيكا. أحضر محلول الملح المتوازن 1x من إيرل ، و 1x PBS ووسط الحث العصبي إلى 37 درجة مئوية في حمام ماء ساخن.

بعد ذلك ، قم بتخفيف فيروس زيكا بتركيز معروف في محلول إيرل 1x إلى التعدد المستهدف للعدوى ، والذي يتراوح عادة بين 0.1 و 10. باستخدام ماصة p200 ، قم بإزالة كل الوسائط بعناية من كل بئر عضوي. بعد ذلك ، اغسل العضيات بسرعة باستخدام 200 ميكرولتر من 1x PBS الدافئ.

عند إزالة الوسائط من كل بئر ، من الأهمية بمكان ألا يلمس المرء العضوي أو يمتصه في الماصة. هذا يمكن أن يسبب أضرارا لا يمكن إصلاحها للعضوية. إذا حدث هذا ، فمن الأفضل التخلص من العضوية.

بعد ذلك ، قم بإزالة كل السائل المتبقي بعناية من كل بئر عضوي باستخدام ماصة p200 أحادية القناة. بعد ذلك ، أضف بسرعة 50 ميكرولترا من محلول إيرل 1x لعدوى وهمية أو محلول فيروس زيكا لكل بئر. تأكد من غمر كل مادة عضوية بالكامل عند الانتهاء ، ضع اللوحة مرة أخرى في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.

بعد اكتمال التعرض الفيروسي ، اغسل كل بئر من العضيات ب 200 ميكرولتر من PBS. اسمح للعضويات بالاستقرار لمدة 15 ثانية ثم قم بإزالة PBS باستخدام ماصة p200 أحادية القناة. أخيرا ، أضف 200 ميكرولتر من وسط الحث العصبي الطازج إلى كل بئر وضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة.

يمكن الجمع بين التلوين باستخدام DAPI و phospho-vimentin و TBR2 و MAP2 لإظهار الهياكل القشرية التي تتشكل داخل العضيات. تشمل هذه الهياكل المنطقة البطينية والمنطقة تحت البطينية والمنطقة المتوسطة والصفيحة القشرية داخل كل وردة. إن زراعة العضيات حتى اليوم 108 ، تسمح للمرء بمراقبة المراحل اللاحقة من التطور.

في حين أن الطبقات القشرية ليست بارزة في هذا النوع من العضيات ، إلا أن التحول الطبيعي إلى تكوين الخلايا الدبقية يحدث تماما كما يحدث في الجسم الحي. بعد ثلاثة أيام من الإصابة بفيروس زيكا ، يصبح الاختلاف في الحجم العضوي واضحا. يعتمد حجم هذا الاختلاف على تعدد الفيروسات للعدوى التي يتم تطبيقها على العضيات.

سيزداد هذا الاختلاف في حجم العضوية خلال الأسبوع التالي حتى تبدأ العضيات المصابة في التفكك. بعد ثلاثة أيام ، ستكون هناك أيضا زيادة في الحطام الخلوي في الآبار المصابة مقارنة بالآبار الوهمية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم اتباع الممارسات المختبرية الآمنة حيث يتم استخدام المواد المعدية القابلة للحياة.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الكيمياء المناعية أو RNAC من أجل الإجابة على أسئلة إضافية حول البيولوجيا التي تنطوي عليها عدوى فيروس زيكا النمائي العصبي.