نموذج إعداد وتصوير اكسوسوميس مجهر إلكتروني

ويصف هذا البروتوكول مختلف التقنيات اللازمة مجهر إلكتروني بما في ذلك صبغة سلبية، وتمزيقها سامسونج للهيكل المفصل، ووضع العلامات لتحديد مواقف محددة من البروتينات في اكسوسوميس المناعية والذهب.

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة مورفولوجيا الحويصلات خارج الخلية النقية وإجراء توطين بروتين محدد داخل حويصلات خارج الخلية باستخدام المجهر الإلكتروني. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في فترة بحث الحويصلة خارج الخلية ، مثل تصنيف الإكسوسوم والبروتينات المحددة الموجودة بداخله. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدامها لمراقبة جزء من بروتينات معينة موجودة داخل وخارج الإكسوسوم.

المترتبة على هذه التقنية هي ضمان تشخيص العديد من الأمراض ، بما في ذلك السرطان والالتهابات البكتيرية. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للإكسوسوم ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على عينات بيولوجية أخرى وحضانة الخلايا الدقيقة وتوطين البروتين المحدد. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب التلوث أثناء الارتباط غير المحدد لجسيمات الذهب المناعي.

باستخدام التقنيات القياسية ، قم بإعداد الإكسوسومات في الثقافة. ثم يقوم بالطرد المركزي الفائق للطافي المزراعي لخلايا HCT116 لتكوير الإكسوسومات من الوسائط. بمجرد تكويرها ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية.

لإصلاح حبيبات الإكسوسوم المنقاة ، أضف ملليلترا واحدا من 2.5٪ جلوتارالديهايد في محلول كاكوديلات سولديوم 0.1 مولار عند درجة الحموضة 7.0. احتضان حويصلات الطبقة الدهنية لمدة ساعة عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بإزالة المثبت وشطف الكريات بمليلتر واحد من محلول عازلة كاكوديلات الصوديوم 0.1 مولار في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

ثم بعد تثبيت العينات بملليلتر واحد من 2٪ رابع أكسيد الأوزميوم لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المثبت واشطف حبيبات الإكسوسوم ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت للصوديوم 0.1 مولار ، وقم بتغيير المخزن المؤقت كل عشر دقائق. ثم قم بتجفيف العينة عن طريق رجها لمدة 10 دقائق في سلسلة من تركيزات الأسيتون المتدرجة.

بعد ذلك ، اخلطي محلولا من ثلاثة أجزاء من الأسيتون وجزء واحد من خليط التضمين منخفض اللزوجة. استبدل الأسيتون بهذا الخليط واحتضان العينة لمدة 30 دقيقة. استمر في زيادة نسبة وسط التضمين منخفض اللزوجة ، مع احتضانه لمدة 30 دقيقة مع كل خطوة.

أخيرا ، احتضان حبيبات الإكسوسوم في 100٪ من خليط التضمين منخفض اللزوجة طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. في اليوم التالي ، قم بتضمين العينة في خليط تضمين نقي منخفض اللزوجة باستخدام قالب تضمين واخبزها لمدة 24 ساعة عند 65 درجة مئوية. باستخدام ميكروتوم فائق ، قم بإعداد أقسام بسمك 60 نانومتر.

ضع الأقسام على شبكة من النيكل وقم بتلطيخ بعضها بنسبة 2٪ من أسيتات اليورانيل لمدة 20 دقيقة ، متبوعا بسترات الرصاص لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، ضع القسم الملون في مجهر إلكتروني ناقل الحركة واعرض العينة باستخدام 80 كيلو فولت واتبع الإعدادات التلقائية لوقت التعرض. مع عرض صورة exosome ، احصل على الصورة واحفظها باستخدام برنامج المجهر.

للبدء ، احتضان شبكات تحتوي على أقسام غير ملوثة بسمك 60 نانومتر في قطرات 50 ميكرولتر من 0.02 مولار جلايسين لمدة 10 دقائق لإخماد مجموعات الألدهيد الحرة. ثم اشطف الأقسام في 100 ميكرولتر من الماء المقطر ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها. بعد الشطف الأخير ، احتضان الأقسام لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في PBS التي تحتوي على 1٪ BSA.

بعد ذلك ، احتضن الشبكات في قطرات من 50 إلى 100 ميكرولتر من الجسم المضاد ل KRS لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، اغسل الشبكات خمس مرات لمدة 10 دقائق لكل منها قطرة من PBS تحتوي على 0.1٪ BSA. بعد ذلك ، انقل الشبكات إلى قطرة من الجسم المضاد الثانوي المناسب واحتضان الأقسام لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

الآن ، اغسل الشبكات خمس مرات لمدة 10 دقائق ، لكل منها قطرة منفصلة من PBS تحتوي على 0.1٪ BSA. قم بتلطيخ الأقسام بنسبة 2٪ من أسيتات اليورانيل لمدة 20 دقيقة في الظلام متبوعا بسترات رينولدز الرصاص لمدة 10 دقائق. ضع القسم الملون في مجهر إلكتروني ناقل الحركة واعرض العينة باستخدام 80 كيلو فولت وقم بتصويرها كما هو موضح سابقا.

من أجل إجراء تلطيخ سلبي ، قم بإصلاح الإكسوسومات المنقاة بعد العزل باستخدام مليلتر واحد من 2٪ بارافورمالدهيد لمدة خمس دقائق. قم بمعالجة شبكات EM الرقيقة ، المطلية بطبقة فورمفار / كربونية ، 200 شبكة ، نحاسية EM مع تفريغ التوهج لمدة دقيقة واحدة ، ثم قم بتحميل خمسة إلى سبعة ميكرولترات من محلول تعليق الإكسوسوم على شبكة واحتضانها لمدة دقيقة واحدة. إذا كان تركيز الإكسوسوم مرتفعا جدا ، فقم بتخفيف التركيز إلى مستوى مناسب.

بتلطيخ الإكسوسومات على الفور بحوالي 20 قطرة من محلول أسيتات اليورانيل المصفى بنسبة 1٪ على سطح شبكة EM. قم بإزالة محلول أسيتات اليورانيل الزائد من الشبكة عن طريق ملامسة حافة الشبكة بورق الترشيح ، ثم اشطف الشبكة بسرعة بقطرة ماء. استخدم زوجا من الملقط لوضع الشبكة على الطاولة وقم بتغطية الشبكة جزئيا بطبق ثقافة.

اترك الشبكة تجف لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ثم قم بتصوير الشبكة أو تخزينها في صندوق شبكة مجهر إلكتروني للمراقبة المستقبلية. ابدأ بمعالجة الطبقة الرقيقة / الكربون المطلية ، 200 شبكة من النحاس EM مع تفريغ التوهج لمدة 30 ثانية. بعد ذلك ، قم بتحميل خمسة إلى سبعة ميكرولترات من الإكسوسومات المثبتة في محلول بارافورمالدهيد بنسبة 2٪ على الشبكة واحتضانها هناك لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، اشطف الإكسوسومات ب 100 ميكرولتر من PBS ، ثلاث مرات لكل منها لمدة 10 دقائق. عالج الشبكات المحتوية على الإكسوسوم ب 50 ميكرولترا من محلول جلايسين 0.5 مولار لمدة 10 دقائق لإخماد مجموعات الألدهيد الحرة. بعد ذلك ، قم بنقل الشبكات إلى قطرة من PBS تحتوي على 1٪ BSA وقم بالحظر لمدة 30 دقيقة.

الآن احتضان الشبكات ب 50 إلى 100 ميكرولتر من الجسم المضاد ل PD-L1 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. اغسل الشبكة بخمس قطرات منفصلة من PBS تحتوي على 0.1٪ BSA لمدة 10 دقائق لكل منها ، ثم انقل الشبكة إلى قطرة من الجسم المضاد الثانوي لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، اغسل الشبكة بخمس قطرات منفصلة من PBS تحتوي على 0.1٪ BSA لمدة 10 دقائق لكل منها ، ثم اغسل الشبكة بقطرتين منفصلتين من الماء المقطر.

عند الانتهاء ، قم بإجراء تلطيخ سلبي باستخدام أسيتات اليورانيل بنسبة 2٪ ، كما هو موضح سابقا ، وقم بتصوير العينات ، أو قم بتخزينها في صندوق شبكة EM للمراقبة المستقبلية. مورفولوجيا الإكسوسوم التي لوحظت هنا هي نتاج تلطيخ سلبي. تظهر هذه الإكسوسومات مورفولوجيا نموذجية على شكل كوب ، وهي قطعة أثرية يمكن أن تحدث أثناء عملية التجفيف.

يمكن الحصول على معلومات إضافية باستخدام تلطيخ الذهب المناعي الكامل ، مثل موقع بروتينات معينة في الإكسوسوم. هنا ، تشير الأسهم البيضاء إلى موقع PD-L1. في الصور المقسمة ، أظهرت الحويصلات بنية تجويف تعرف باسم السمة الهيكلية للإكسوسومات.

يمكن أيضا تلطيخ هذه أيضا باللون المناعي لتحديد بروتينات معينة في جميع أنحاء الإكسوسومات. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء تقنية تلطيخ الذهب المناعي في الخلايا الليفية بعد التحضير البسيط والتقسيم إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طريقة أخرى مثل تلوين المناعة المزدوجة لتحديد موقع بروتينين مختلفين في وقت واحد.

بعد كل تطور ، يمكن استخدام هذه التقنية في مجال الحويصلات خارج الخلية لاستكشاف تشخيص الأمراض في الخزعات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد توطين بروتين معين داخل الإكسوسوم. لا تنس أنهم يعملون مع محاليل مثبتة ، مثل الكلورهيدرات ، وبارافورمالدهيد ، ورباع أكسيد الأوزميوم يمكن أن يكون ضبابيا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل غطاء الدخان الجيد التهوية وقفازات اللاتكس أثناء تنفيذ هذا الإجراء.