استجابة جذع الدماغ السمعية والخارجي الشعر خلية تسجيل المشبك تصحيح كامل الخلية في الفئران بعد الولادة

ويصف هذا البروتوكول أساليب لتسجيل استجابة جذع الدماغ السمعية من الجراء الفئران بعد الولادة. دراسة تطور وظيفي لخلايا الشعر الخارجي، يرد وصف للإجراءات التجريبية لتصحيح كامل الخلية المشبك تسجيل في عزل خلايا الشعر الخارجي خطوة بخطوة.

الهدف العام من هذا الفحص الفيزيولوجي الكهربي هو التحقيق في التغيرات المورفولوجية والوظيفية لخلايا شعر القوقعة أثناء تطور ما بعد الولادة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال قسم المساعد السمعي مثل متى تكتسب خلايا الشعر وظائفها أثناء بداية السمع؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أننا قادرون على تقييم وظيفة خلايا الشعر الفردية ، المعزولة عن صغار الفئران بعد الولادة.

توضيح الإجراء من Wenlu Pan و Shasha Guo و Nana Xu الذين كانوا طلابا من مختبرنا. لبدء هذا الإجراء ، ضع المخدر في قالب رغوة البولي إيثيلين لشل حركة جسم. ثم ضع على طاولة مضادة للاهتزاز في غرفة مخففة للصوت.

حافظ على درجة حرارة جسم عند 37.5 درجة مئوية باستخدام وسادة تدفئة. بعد ذلك ، امسح منطقة الرأس بنسبة 70٪ من الإيثانول. قم بعمل شق بطني من واحد إلى ملليمترين بشكل جانبي إلى الصيوان الخارجي لوضع القطب المرجعي أو القطب الأرضي.

ثم ضع قطبا كهربائيا للتسجيل تحت الجلد فوق رأس الجمجمة. باستخدام مولد الوظيفة ، قم بإنشاء رشقات نارية معايرة بترددات وشدة مختلفة. قم بتوصيل المحفزات الصوتية من خلال مكبر صوت إلكتروستاتيكي يقع على بعد 10 سم من رأس.

للحصول على استجابات جذع الدماغ السمعي ، يتم تصفية الإمكانات المستحثة من الصوت وتضخيمها ومتوسطها باستخدام معالج متعدد الوظائف. تتم مراقبة تسجيل ABR لمدة 40 دقيقة عبر الإنترنت وتخزينه لتحليله في وضع عدم الاتصال. في هذا القسم ، قم بتعقيم رأس عن طريق الرش بنسبة 70٪ من الإيثانول.

بعد ذلك ، افتح الجمجمة على طول خط الوسط السهمي بالمقص وقم بإزالة الدماغ لكشف الأذن الداخلية. بعد ذلك ، انقل الأذن الداخلية إلى طبق بتري مقاس 35 ملم مليء بثلاثة ملليلتر من L-15 Medium من Leibovitz's Medium. تحت مجهر التشريح ، استخدم ملقطا دقيقا لإزالة الكبسولة العظمية للقوقعة.

بعد ذلك ، قم بفك OC و SV المرتبطين من modiolus. من خلال إمساك الجزء القاعدي من SV بالملقط ، افصل OC عن SV تماما عن طريق الفك ببطء من القاعدة إلى القمة. بعد ذلك ، قم بتقطيع OC بالتساوي إلى ثلاث قطع باستخدام مقص ناعم.

يجب تنفيذ جميع الخطوات في L-15 المثلج في أسرع وقت ممكن من أجل تقليل التدهور وتدهور الأنسجة. في هذه الخطوة، باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر، انقل أجزاء OC إلى شريحة زجاجية. قم بإصلاحها ب 100 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد لمدة أربع ساعات على الأقل عند أربع درجات مئوية.

بعد ذلك ، اغسل الأنسجة عن طريق إزاحة بارافورمالدهيد ب 100 ميكرولتر من PBS الطازج. ثم اغسل المنديل ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة. بعد ذلك ، احتضان الأنسجة بعامل نفاذية 0.3٪ في PBS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد 30 دقيقة ، تخلص من عامل النفاذية واغسل المنديل ثلاث مرات باستخدام PBS. بعد ذلك ، قم بسد الأنسجة باستخدام مصل الماعز العادي بنسبة 10٪ و PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. احتضان الأنسجة بالجسم المضاد المضاد للبريستين C ومحلول مانع لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو عند أربع درجات مئوية طوال الليل.

ثم اغسل المنديل ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة خمس دقائق في كل مرة. بعد ذلك ، احتضان الأنسجة بجسم مضاد ثانوي مترافق Alexa 488 في محلول حجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. اغسل المنديل ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة خمس دقائق في كل مرة في الظلام.

بعد ذلك ، احتضان الأنسجة بالرودامين فالودين لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. اغسل المنديل ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة خمس دقائق في الظلام. ثم قم بتركيب العينة على شريحة زجاجية بوسط تثبيت.

قم بتصويره باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر باستخدام ليزر 405 نانومتر و 488 نانومتر و 594 نانومتر. في هذا الإجراء، استخدم مجتذب الماصة والمزيق الدقيق. اصنع ماصات رقعة بقطر طرف من اثنين إلى ثلاثة ميكرون.

بعد ذلك، قم بإعادة ملء الماصات بمحلول داخل الخلايا. باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر ، انقل قطعة من OC إلى طبق بتري مقاس 35 ملم. هضم الأنسجة ب 100 ميكرولتر من وسط الهضم الأنزيمي لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم بإزاحة وسط الهضم الأنزيمي ب 100 ميكرولتر من L-15. قطع الأنسجة إلى قطع صغيرة باستخدام مشرط دقيق لعزل خلايا الشعر. بعد سحب العينة اللطيف، انقل الخلايا إلى حجرة بلاستيكية صغيرة محلية الصنع مملوءة بمحلول حمام خال من الإنزيم.

بعد ذلك ، ضع الغرفة على مسرح المجهر المقلوب وابحث عن OHCs الانفرادية ذات المظهر الصحي. بعد ذلك، قم بتحميل ماصة التصحيح في مرحلة رأس مضخم الصوت 700B. ضع ماصة الرقعة حول الجزء السفلي من خلية الشعر الخارجية.

بعد ذلك ، تقوم رقعة الخلية بأكملها بتثبيت OHC عن طريق إغلاق الجدار الجانبي لجسم الخلية. استخدم الشفط الخفيف حتى يتمزق غشاء الخلية. ثم اضبط إمكانات الاحتفاظ على 70 مللي فولت.

تعتبر الخلايا ذات مقاومة الوصول التي تتراوح من 10 إلى 17 ميغا أوم ومقاومة الغشاء التي تتراوح من 100 إلى 500 ميغا أوم تكوينا ناجحا للخلية بأكملها. قم بتطبيق جهد فرط الاستقطاب وإزالة الاستقطاب على الخلية لاستنباط تيارات الخلية بأكملها. قم بقياس السعة الغشائية ل OHCs باستخدام بروتوكول تحفيز جهد موجة جيبية يتم التحكم فيه بواسطة برنامج مشبك التصحيح.

اضبط نطاق جهد التحفيز من 140 إلى 110 مللي فولت وقم بتخزين البيانات لتحليلها في وضع عدم الاتصال. بعد الهضم اللطيف ، تم عزل OHCs من OC. تم إجراء تسجيلات مشبك جهد الخلية بالكامل من OHCs المعزولة بشكل حاد من قوقعة الفئران. يظهر هنا مثال تمثيلي لتيار الخلية بأكمله المسجل من P9 OHC المعزول استجابة لجهد الغشاء الذي تغير من 140 إلى 107 مللي فولت.

يوضح هذا الشكل السعة الغشائية غير الخطية التي تم الحصول عليها من اثنين من OHCs في أعمار مختلفة. تم تركيب استجابات جهد السعة على وظيفة بولتزمان. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ساعتين ، إذا تم تنفيذها بشكل مناسب.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء تدابير أخرى مثل النشاف الغربي و PCR من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل تقييم مستوى التعبير عن بعض البروتينات ، مثل البريستين في خلايا الشعر الخارجية. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال خلايا الشعر لاستكشاف الخصائص الفيزيولوجية الكهربية في القوقعة والجهاز الدهليزي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التحقيق في التغيرات المورفولوجية والوظيفية لخلايا شعر القوقعة أثناء تطور ما بعد الولادة.