تصور داخل الخلايا المطوقة الاتجار بواسطة عمر Fluorescence التصوير المجهري

الهدف العام من هذه التجربة هو تصور التكوين المعقد لبروتينات SNARE في الخلايا الحية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات تهريب الأغشية ، مثل تحديد مجموعات بروتينات SNARE التي تحفز خطوات الاتجار بالعضيات المحددة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتصور المباشر للمواقع الخلوية حيث تنخرط SNAREs في تكوين معقد.

في هذه التجربة ، تم استخدام 900،000 خلية HeLa مقسمة بين ثلاثة أنابيب Eppendorf للتعداد. قم بنقل الخلايا كما هو موضح في بروتوكول النص باستخدام التركيبات التالية. العينة رقم واحد مع بناء بناء syntaxinin-4 mCitrine ، والعينة الثانية مع syntaxinin-4 mCitrine و VAMP3-mCherry ، والعينة رقم ثلاثة مع syntaxinin-3 مدمجة في كل من mCitrine و mCherry.

استزراع الخلايا المنقولة في DMEM عالي الجلوكوز المزود ب 10٪ FCS و 1٪ مضاد حيوي مضاد للميكروبات عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 في حاضنة زراعة الخلايا بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، قم بشفط الوسط واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام وسيط تصوير الخلايا الحية لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، ضع الخلايا في وسط تصوير جديد.

لبدء هذا الإجراء ، ضع العينة الثانية عند 37 درجة مئوية ، على مرحلة ساخنة ، تحت مجهر متحد البؤر للتصوير مدى الحياة في المجال الزمني مع مصدر إثارة نبضي للفلوروفور المتبرع والحصول على البيانات التي تم حلها بوقت. قبل كل فحص مجهري للتصوير مدى الحياة الفلورية أو قياس FLIM ، حدد خلية ذات تعبير مرئي عن بروتينات SNARE المسماة mCitrine و mCherry وسجل صورة متحدة البؤر تبلغ 256 × 256 بكسل مع إثارة متزامنة لكل من الفلوروفورات. سجل صورة FLIM بالنقر فوق تشغيل FLIM مع تسجيل صورة FLIM بنفس الأبعاد والدقة المكانية مثل الصورة متحد البؤر المسجلة سابقا.

سجل الصورة بما لا يقل عن 50،000 فوتون لتحليل FLIM للخلية بأكملها أو ما لا يقل عن 400 فوتون لكل بكسل. من المهم تسجيل قياسات FLIM على بعد ميكرومتر واحد على الأقل من سطح الزجاج لتجنب عرض الانعكاس. كرر التصوير من خلايا متعددة في العينة رقم اثنين وللخلايا في العينة رقم واحد والعينة رقم ثلاثة.

بعد ذلك ، ضع زلة غطاء زجاجي نظيفة على مرحلة المجهر لتسجيل وظيفة استجابة الأداة أو IRF. اضبط أحادي اللون لكاشف الانبعاث على الطول الموجي للإثارة وانقر فوق الزر قم بتشغيل FLIM لتسجيل صورة FLIM مع تشتت الظهر من زلة الغطاء الزجاجي. سيتم تحويل تسجيلات الصور إلى صور FLIM باستخدام برنامج تحويل PT32ICS.

قم بتكوين البرنامج. قم بتعيين الإخراج إلى ImageJ لإنشاء صور FLIM. اضبط حجم الصورة على 256 × 256 بكسل والقناة إلى اثنين.

اضغط على تحويل وقم بتحميل واحد أو أكثر من آثار الفوتون. استمر في الضغط على مفتاح التحكم لتحديد آثار فوتون متعددة. يجب إنشاء صور FLIM في نفس المجلد حيث يتم حفظ آثار الفوتون.

ابدأ بفتح برنامج تحليل البيانات القادر على التوافق مع التفكيك. قم باستيراد الملف النصي الذي يحتوي على الرسم البياني لكل أثر فوتون. أعد تنظيم الجدول بحيث يكون IRF في العمود الثاني من الجدول ، بجوار قيم الوقت في العمود A.حدد جودة آثار الفوتون المسجلة عن طريق تحديد جميع الأعمدة.

لا تحلل آثار الفوتون ذات ذروة الانعكاس العالية. مثال موضح هنا. استخدم مفتاح التحكم لتحديد جميع الأعمدة التي تحتوي على الرسوم البيانية ذات العمر الافتراضي التي يتم التحكم فيها بالجودة والتي سيتم تركيبها، بالإضافة إلى IRF في العمود B، وقم بتحميل التركيب غير الخطي.

قم بتحميل وظيفة الملاءمة غير المعقدة عن طريق إضافة هذه الوظيفة إلى برنامج التحليل. حدد ملف الدالة مناسب. تتناسب هذه الوظيفة مع الرسوم البيانية لعمر التألق مع وظيفة اضمحلال أسية أحادية مفككة مع IRF.

إجراء تحجيم المحور X للمنحنيات المجهزة. تناسب المنحنيات بالضغط على الملاءمة. سيؤدي هذا إلى تحويل الملاءمة وإنشاء ورقة تقرير في المصفوفة مع الجدول الذي يحتوي على إزاحات وسعة عمر الفلورة.

كما سيقوم بإنشاء ورقة بيانات تحتوي على المنحنيات المجهزة وبقايا الملاءمة. تظهر الصور التمثيلية متحدة البؤر للخلايا المروحية التي تعبر فقط عن بناء الجملة أربعة mCitrine ، أو snytaxin four mCitrine مع VAMP3 mCherry ، أو بناء الجملة ثلاثة mCitrine mCherry جنبا إلى جنب. في هذه الصور المصاحبة لعمر التألق ، يشير اللون إلى متوسط عمر الفلورسنت الظاهر.

ثم تم تعقيد الصور بكثافة التألق للفلوروفور المتبرع ب mCitrine. التالي هي نفس الصور مع الملاءمة لوظائف الاضمحلال ثنائية الأسية. تشير ألوان البكسل إلى الكسور المقدرة لبناء الجملة أربعة في مركب مع VAMP3.

تم قياس وظيفة استجابة الأداة للإعداد باستخدام التشتت الخلفي على واجهة الماء الزجاجية. يتم عرض الرسوم البيانية لعمر الخلية الكاملة للخلايا التي تعبر عن بناء الجملة أربعة فقط mCitrine ، والمشاركة في التعبير عن بناء الجملة أربعة mCitrine مع VAMP3 mCherry ، والتعبير عن بناء الجملة ثلاثة mCitrine mCherry جنبا إلى جنب. تظهر اللوحة E تراكبا لمنحنيات الاضمحلال للوحات B و C و D.تظهر التطعيمات نفس الرسوم البيانية ، ولكن مع القياس اللوغاريتمي للمحور Y.

أدى الرسم البياني الفلوري الذي تم تسجيله بالقرب من سطح زلة غطاء المجهر إلى ذروة انعكاس كبيرة ، تصورها المنطقة المظللة الصفراء. أخيرا ، يتم عرض رسم بياني مدى الحياة مع ملاءمة تمثيلية مع وظيفة الاضمحلال الأسي الثنائي. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ساعتين إلى أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تسجيل خلايا متعددة بينما يمكن أن تؤثر مستويات التعبير عن المتبرع والمعترض SNARES على مدى الحياة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنشيط الخلايا من أجل الإجابة على أسئلة محددة لنوع الخلية تتعلق بإعادة تجذير تهريب الأغشية بوساطة SNARE. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تهريب الأغشية لاستكشاف المسارات بين الخلايا لحركة مرور العضيات في جميع الخلايا حقيقية النواة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسجيل وتحليل بيانات FLIM. لا تنس أن العمل مع الكائنات المعدلة وراثيا والليزر عالي الطاقة يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل القفازات وحماية العين ، أثناء محاولة هذا الإجراء.