اختيار ابتمر الحمض النووي ملزم إستر حامض فثاليك وتوصيف وتطبيق أبتاسينسور الكهروكيميائية

الهدف العام من هذا الإجراء هو اختيار أبتامير الحمض النووي الخاص بالمجموعة إلى جزيئات صغيرة عالية الكارهة للماء واستخدام أبتامير المحدد لتطوير مستشعر حيوي كهروكيميائي حساس. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال اختيار الأبتامير، حول كيفية اختيار وتوصيف الأبتامير الخاص بالمجموعة عندما تكون الأهداف جزيئات شديدة الكارهة للماء. في حين أن الجزء الأكثر فائدة في هذه الطريقة هو تطوير أجهزة الاستشعار الحيوية الكهروكيميائية للكشف عن العناوين.

يجب أن تعمل هذه المستشعرات الحيوية أيضا مع قياسات تقارب أبتامير. لبدء التفاعل ، أضف 100 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase إلى منتج aptamer PCR المنقى. دوامة الخليط حتى يذوب الراسب.

تفاعل نوكلياز لامدا حساس لتركيز الملح وهو منتج يجب أن يتكاثر عن طريق ترسيب الإيثانول ولكن إيزوبروبانول آخر. ضع في كل من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الخمسة ، وخمسة ميكرولترات من محلول الأبتامير ، و 11 ميكرولترا من الماء الخالي من الرناس ، وميكرولترين من محلول التفاعل 10x. أضف ميكرولترين من الماء الخالي من الرناس ومحاليل من وحدتين وخمسة وثماني و10 وحدات من نوكلياز لامدا في الماء الخالي من الرناس إلى أنبوب واحد لكل منهما.

تخلط جيدا مع سحب لطيف. احتضان الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 35 دقيقة وعند 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ثم امسك الأنابيب عند أربع درجات مئوية وقم بإعداد جل صفحة أصلي بنسبة 12٪.

أضف إلى كل أنبوب ميكرولتر واحد من صبغة التحميل وأربعة ميكرولترات من الماء الخالي من الرناز. قم بتشغيل الخلطات في هلام الصفحة الأصلي عند 150 فولت لمدة 45 دقيقة. تحديد أقل كمية من نوكلياز لامدا اللازم لتوليد الحمض النووي الفردي الذي تقطعت به السبل بالكامل.

قم بإجراء تفاعل واسع النطاق لتوليد الحمض النووي أحادي الشريطة. لكل هدف ربط يتم اختباره ، احتضان 10 ميكرولتر من متوسط الخرز المغناطيسي المشفر DBP الوظيفي مع 500 ميكرولتر من محلول ميكرومولار واحد من DBP-1 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة أثناء الدوران. ثم تخلص من الطافف.

اغسل الخرزات أربع مرات بأجزاء 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لربط PAE وأعد تعليق الخرزات في 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت لربط PAE. احصل على 10 تشتتات اختبار هدف ربط ميكرومولار في المخزن المؤقت لربط PAE. إنه لأمر رائع أن تذهب إلى تشتت الأهداف الكارهة للماء في المخزن المؤقت الملزم ل PAE.

لضمان ذلك, هناك إثراء للمكتبة, تم اختيارها في إطار اختبارات التقارب. أضف 10 ميكرولتر من الخرز DBP-1 إلى 110 ميكرولتر من كل محلول اختبار مستهدف. احتضان الخلائط لمدة ساعة واحدة وجمع المواد الطفية عن طريق الفصل المغناطيسي.

خفف المواد الطافية 100 أضعاف واستخدم ثلاثة ميكرولتر لكل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي. احسب التقاربات النسبية بقسمة عدد DBP-1 الذي تم إصداره في وجود عينة الاختبار على عدد DBP-1 الذي تم إصداره في المخزن المؤقت لربط PAE وحده. قبل إجراء القياسات ، قم بتجميع وتنقية مسبار التسلسل الأساسي ذو الثيول القائم على DBP-1 ومسبار الإشارات.

أعد تكوين المسبار الثيولي ومسبار الإشارات وك100 محلول ميكرومولار في الماء الخالي من النوكلياز. بعد ذلك ، قم بتلميع قطب كهربائي من الذهب بقطر ملليمترين على سطح يشبه المرآة باستخدام مسحوق ألومينا واحد و 0.3 و 0.5 ميكرون وقطعة قماش من الألياف الدقيقة لمدة خمس دقائق لكل منهما. قم بتقطيع القطب الكهربائي في ماء نقي للغاية لمدة خمس دقائق بعد كل تلميع.

اغمر القطب المصقول في محلول 0.5 مولار من حامض الكبريتيك. قم بتنظيف القطب الكهربائي ب 35 عملية مسح لقياس الفولتامتر الدوري المتتالية من سالب 0.4 إلى موجب 1.2 فولت مقابل كالوميل الزئبق عند 100 مللي فولت في الثانية. بعد ذلك ، قم بإعداد خليط من مسبار ثيول 0.5 ميكرومولار DBP-1 في أنبوب طرد مركزي رقيق الجدران.

و 0.5 ميكرومولار FC معدل DBP-1 في 100 ميكرولتر من PBS. سخني الخليط في حمام مائي على 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم اترك الخليط يبرد إلى درجة حرارة الغرفة في الحمام المائي.

أضف ميكرولتر واحدا من محلول مخزون TCEP سعة 10 ملليمولار إلى الخليط المبرد واحتفظ به في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. ثم اغمر القطب الذهبي النظيف في الخليط لمدة 12 ساعة في درجة حرارة الغرفة. اشطف القطب باستخدام PBS ثم اغمر القطب الكهربائي في محلول مليمولي واحد من PEG الثيولي في PBS لمدة ساعة واحدة.

اشطف القطب جيدا باستخدام المخزن المؤقت المجاني لربط PAE واغمر القطب في المخزن المؤقت. بعد ذلك صوتنة الخلايا الإلكتروليتية من القطب المضاد البلاتيني وقطب مرجعي كالوميل مشبع لمدة دقيقتين لكل منهما في ماء نقي للغاية ومخزن مؤقت ملزم PAE بالتسلسل. افتح الموجة المربعة لبرنامج أداة قياس الجهد وأدخل معلمات التجربة.

املأ خلية كهربائية نظيفة بمخزن مؤقت لربط PAE خال من الهدف. قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية الثلاثة النظيفة بجهد واغمر الأقطاب الكهربائية في المخزن المؤقت. الحصول على مسح SWV في الخلفية.

ثم اغمر قطب العمل الذهبي في محلول 10 بيكامولار DEHP في مخزن مؤقت ملزم PAE لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اشطف القطب جيدا باستخدام المخزن المؤقت لربط PAE. اغمر جميع الأقطاب الكهربائية الثلاثة في مخزن مؤقت جديد لربط PAE واجمع منحنى SWV آخر باستخدام نفس المعلمات كما كان من قبل.

كرر هذه العملية مع زيادة تركيزات DEHP للحصول على منحنى معايرة بالتحليل الحجمي. تم العثور على الحد الأدنى من نوكلياز لامدا اللازم للحصول على الحمض النووي أحادي الخيط فقط هو وحدتين تستندان إلى تفاعلات صغيرة النطاق. تم تحديد مرشح أبتامر DBP-1 بواسطة SELEX متبوعا بتسلسل عالي الإنتاجية.

أظهر DBP-1 خصوصية مجموعة جيدة لمتجانسات PAE. استجاب جهاز استشعار الكيروبوكيميائي باستخدام DBP-1 بشكل انتقائي ل DEHP على الملوثات البيئية الشائعة الأخرى. كان جهاز الاستشعار شديد الحساسية ل DEHP مع استجابة بتركيزات منخفضة تصل إلى 10 بيكامولار.

جسيمات الليزر حيث يتم اختيار وتوصيف الأبتامير للجزيئات الصغيرة الكارهة للماء الخطرة. يعد توصيف وتطاير الأبتامير للجزيئات الصغيرة الكارهة للماء مثل PAE أمرا صعبا بشكل عام ، نظرا للذوبان في الماء المحدود للغاية وانخفاض وزن الجزيئات ل PAEs. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية صنع أجهزة استشعار كهروكيميائية وكيفية استخدامها لاكتشاف العناوين.