إينتيراكتومي--Seq: بروتوكول لبناء مكتبة دومينومي والتحقق منها واختيار عرض بالعاثية وتسلسل الجيل القادم

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في الأبحاث القائمة على البروتين مثل شرح البروتينات الجديدة أو مجالات البروتين ، وتوصيف الخصائص الهيكلية والوظيفية للبروتينات المعروفة ، تعريف شبكات التفاعل البروتينية أو توقيعات الأجسام المضادة المضادة في ظروف مختلفة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها غير متحيزة تمامًا وعالية الإنتاجية ووحدات لأي نوع من الدراسة تتراوح بين جين واحد إلى جينوم كامل. بناء مكتبة domainone مفيد جدا للدراسات الوظيفية.

ويمكن نقلها إلى سياق عرض phage واستخدامها للاختيار ضد أهداف مختلفة مثل البروتينات ملزمة أو الأجسام المضادة النقية. إن اقترانه مع الـ NGS يتيح تحليلاً بالغ الحساسية والقوي. في الوقت نفسه ، فإن أدوات الويب التي تم تطويرها على وجه التحديد تعطي توصيفًا دقيقًا للنطاق بأكمله و interactome.

لبناء مكتبة ORF أولاً، sonicate الحمض النووي مع 30 ثانية نبضات في 100٪ الإخراج. بعد سونيكيشن، تحميل سلم والحمض النووي سونيكاتيد على 1.5٪ agarose هلام. ثم ابدأ وحدة الكهرباء في خمسة فولت لكل سنتيمتر لمدة 15 دقيقة.

وكهربية جل agarose يظهر وجود مسحة الحمض النووي تؤكد سونيكيشن. هذا بالمقارنة مع الفرقة الصلبة التي تم الحصول عليها من الحمض النووي لا تخضع ل sonication. ثم قطع جزء هلام مع تشويه الحمض النووي مسحة وتنقية باستخدام عمود أساس هلام استخراج عدة.

قياس تركيز الحمض النووي المنقى في مطياف الأشعة فوق البنفسجية. ثم اتبع تعليمات الشركة المصنعة وعلاج خمسة ميكروجرام من إدراج مع ميكرولتر واحد من مزيج انزيم سريع الفظ. ثم تعطيل مزيج انزيم في 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

لإعداد متجه التصفية، هضم أولاً خمسة ميكروغرامات من متجه الاستنساخ المنقى مع إنزيم تقييد EcoRV. ثم تحميل ناقلات هضمها وغير مهضومة وعلامة الجزيئية على 1٪ agarose هلام. ثم الحرارة تعطيل إنزيم تقييد في 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

بعد ذلك، phosphorylate ناقلات هضم مع خمس وحدات من إنزيم الفوسفاتاتيز و 1/10 حجم من 10X فوسفاتاتيز العازلة. ثم احتضان الخليط في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ثم تعطيل إنزيم فوسفاتاز في 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، استخراج البلازميد من هلام وتنقية الحمض النووي. ثم قياس تركيز الحمض النووي في مطياف الأشعة فوق البنفسجية. لتنفيذ تفاعل الربط، أضف 400 نانوجرام من إدراج الفوسفوريلي إلى ميكروغرام واحد من المتجه المهضم، ومخزن 10X T4 للأربطة الحمض النووي و T4 الحمض النووي للرابطة إلى حجم نهائي من 100 ميكرولترات.

ثم احتضان رد فعل الربط في 16 درجة مئوية لليلة واحدة. في اليوم التالي، ابطل الحرارة الرباط عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، أضف 1/10 حجم من ثلاثة خلات الصوديوم الضرس في 5.2 و 2.5 وحدات تخزين من الإيثانول 100٪ لتعجيل المنتج الربط.

لتعجيل الحمض النووي، مزيج الكواشف وتجميد في ناقص 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد 20 دقيقة، الطرد المركزي في أعلى سرعة لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي، طرد الماحتَر.

إلى بيليه، إضافة 500 ميكرولترات من الإيثانول البارد 70٪ والطرد المركزي مرة أخرى. تجاهل المغرور في نهاية الطرد المركزي. مرة واحدة في بيليه هو الهواء المجفف، حل الحمض النووي عجل في 10 ميكرولترات من الماء.

قبل إجراء كهربية، ترتيب العدد المناسب من أنابيب microcentsrifuge و 0.1 سنتيمتر الكتروبورات الكهربائية على الجليد. ثم إضافة ميكرولتر واحد من المنتج الربط النقي إلى 25 ميكرولترات من الخلايا. ثم الماصات الحمض النووي، وخلية خليط إلى cuvette الكهربائي الباردة ونفض الغبار الأنبوب.

ثم امسح الماء من الخارج من cuvette ووضعها في وحدة الكهرباء وضرب النبض. بعد أن يكون الكهربائي قد انتهى ، بسرعة إضافة ملليلتر واحد من السائل 2X YT المتوسطة دون أي مضاد حيوي للخلايا في cuvette. ثم نقل الخليط الخلوي إلى أنبوب 10 ملليلتر.

ترك أنبوب على شاكر في 220 الثورات في الدقيقة الواحدة في 37 درجة مئوية لمدة ساعة. لوحة التخفيفات من المكتبة على 10 سم 2X YT أجار لوحات تكملها الكلورافينيكول، أمبيسيلين والكلورافينيكول فقط. وهذا هو الحصول على مستعمرات واحدة لاختبارها بواسطة PCR وإجراء المعايرة.

المقبل، لوحة الخلايا المختصة المحولة على 15 سم 2X YT لوحات أغار تكملها الكلورافينيكول و أمبيسيلين. ثم احتضان لوحات في 30 درجة مئوية لليلة واحدة. في اليوم التالي، عد المستعمرات اختيار التخفيف حيث أنها قابلة للعد.

ثم حساب حجم المكتبة. يتم حساب حجم المكتبة على النحو التالي، متوسط عدد مستعمرة مرات عامل التخفيف مرات إجمالي حجم المكتبة. وينبغي أن يكون حجم المكتبة في ترتيب 10 إلى قوة ستة مستنسخين.

إذا كان تركيز الأمبيسيلين هو الأمثل لأداء المزيد من التصفية، وعدد استنساخ يقلل إلى واحد إلى 20 من التي تم الحصول عليها في غياب هذا المضاد الحيوي. لاختبار للمستعمرات الإيجابية، استخدم نصيحة لالتقاط حوالي 15 إلى 20 مستعمرة واحدة. ثم تمييع المستعمرات مع 100 ميكرولترات من 2X YT المتوسطة دون المضادات الحيوية.

بعد ذلك ، تضخيم PCR 0.5 ميكرولتر من الثقافة كقالب الحمض النووي مع بوليميراز الحمض النووي Taq. أثناء PCR، تشغيل 25 دورات من التضخيم باستخدام درجة حرارة الصلب من 55 درجة مئوية وتمديد الوقت من 40 ثانية في 72 درجة مئوية. تحقق من أن طول الإدراج في النطاق المتوقع من 150 إلى 750 زوج قاعدة.

وأنّ مستعمرات مختلفة يقدّم إدراج مختلفة مع حجم مختلفة. وهذا يشير إلى إعداد مكتبة جيدة من حيث التغير. بعد ذلك، أضف ثلاثة ملليلترات من 2X YT المتوسطة الطازجة إلى لوحات 150 ملليمتر لجمع البكتيريا.

ثم حصاد البكتيريا باستخدام مكشطة معقمة. بعد خلط جيدا، إضافة 20٪ الجلسرين وترك في ناقص 80 درجة مئوية في aliquots للاستخدام في المستقبل. للاستخدام الفوري، تنفيذ عمود أساس طقم استخراج plasmid لتنقية الحمض النووي plasmid من واحدة من aliquots من المكتبة قبل إضافة الجلسرين.

قياس تركيز الحمض النووي في مطياف الأشعة فوق البنفسجية ومن ثم تخزين العينات في ناقص 20 درجة مئوية حتى الاستخدام. استخدام 2.5 ميكرولترات من المكتبة كقالب الحمض النووي لتضخيم PCR. تعيين ظروف الدراجات الحرارية وبدء تشغيل.

بعد ذلك، استخدم مجموعة PCR فهرس لتنفيذ فهرس PCR. هذا سوف تسلسل المكتبات المفهرسة المزدوجة داخل تشغيل Multixed Illumina. ثم تعيين ظروف thermocycler وبدء تشغيل.

بعد تنقية مع الخرز XP AMPure، للتحقق من حجم، تشغيل ميكرولتر واحد من واحد إلى 10 تخفيف المكتبة النهائية على bioanalyzer. ثم تحديد كمي عن طريق اختيار المنطقة من تتبع المكتبة النهائية. هذه التمثيلات التخطيطية demonstate أنه بعد الاستنساخ في P مرشح ناقلات، فقط المستعمرات المقابلة لORFs تنتج وظيفية بيتا lactamase في وجود المضادات الحيوية.

بعد تصفية انخفاض في عدد استنساخ من 20 من المتوقع أضعاف. مع ORFs جيدة المجلد تنمو في تركيزات أعلى المضادات الحيوية. وعلاوة على ذلك، يمكن بسهولة استرداد أجزاء ORF من المكتبة المصفاة.

تم بناء مكتبة فيجميد ORF لأداء اختيار عرض phage ضد البروتينات المستهدفة أو الأجسام المضادة. ثم يتم تحليل جميع المكتبات والمخرجات التي تم الحصول عليها بعمق من قبل NGS. وتوفر هذه القوائم معلومات كاملة عن تنوع المكتبات، ووفرة كل جزء من الأجزاء المختارة، ورسم خرائط دقيقة لها.

وأخيراً، فإن أداة البحث interactome التي تم تطويرها تولد قراءات تسلسلية أولية تتراوح إلى قائمة المجالات المفترضة مع الشروح الجينومية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية بناء مكتبة domainome والتحقق من صحتها من مصدر الحمض النووي المطلوب. وإجراء فحص عالي الإنتاجية للمكتبة من خلال تسلسل الجيل القادم.

لقد قمنا بتحسين تسلسل مكتبات تصفية ORF مع منصات Illumina ووضعنا أداة ويب تجعل من الممكن تحليل هذا النوع من البيانات دون الحاجة إلى مهارات البرمجة.