بروتوكول لفج العرض وتقارب اختيار طريق الطعوم البروتين المؤتلف

الهدف العام من هذا الإجراء هو اكتشاف التفاعلات البروتينية مع جزيئات الطعم المثبتة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق الحصول على الطعم وتثبيته. وتتمثل الخطوة الثانية في إدخال مكتبة العاثيات المراد فحصها إلى الطعم في ظل ظروف تعزز عملية الارتباط.

بعد ذلك، تتم إزالة العاثيات غير المرتبطة عن طريق الغسل الصارم. بينما تُستخدم العاثيات المرتبطة لإصابة البكتيريا قبل استعادتها. وتتمثل الخطوة النهائية في تضخيم العاثيات المرتبطة من أجل الدورة التالية من الاختيار بالالفة.

في النهاية، عندما يصل عيار العاثيات (phage titer) إلى مرحلة الثبات، يتم اختيار لويحات منفردة وتسلسلها لتحديد البروتينات التي تمتلك أعلى ألفة للبروتين المتأخر (lagging) المثبّت في ظل ظروف الارتباط التجريبية. يمكن أن تساعد هذه العملية في الإجابة على أسئلة رئيسية تتعلق بالتفاعلات بين البروتينات والبروتينات. تبدأ هذه العملية بوضع البروتين المؤتلف المنقى في قاع أطباق المعايرة الدقيقة (microtiter plates) كما هو موضح في البروتوكول المكتوب.

تتمثل الخطوة التالية في تلقيح 50 مليلتر من وسط Luria burani المحتوي على 100 ميكروغرام/مليلتر من الأمبيسيلين في دورق إرلنماير سعة 250 مليلتر باستخدام مستعمرة واحدة سبق إنماؤها كما هو موضح في البروتوكول النصي، ثم تحضن عند 37 °C وبسرعة 200 RPM في هزاز أفقي، واستخدام مقياس الطيف الضوئي لمراقبة كثافة الخلايا حتى يتم الحصول على كثافة ضوئية عند 600 نانومتر تتراوح بين 0.5 إلى 0.6. بعد ذلك، تُصب الخلايا في أنبوب Falcon سعة 50 مليلتر أو ما يماثله وتُحفظ عند 4 °C حتى وقت الاستخدام، وعادة ما تظل الخلايا حية لمدة أسبوع تقريبًا. وفي اليوم الأول، يتم التحضير للاختيار بالتقارب (affinity selection) كما هو موضح في البروتوكول النصي في صباح اليوم الثاني.

ضع تسع دورق إرلنماير سعة 250 milliliter معقمة بجهاز الأوتوكلاف في ملاقط جهاز رجّ وتحضين، ثم قم بتلقيح 500 milliliters من lal burani باستخدام 500 microliters من إحدى المزارع الليلية لخلايا BLT 5 4 0 3 المصابة بالبكتيريوفاج والتي تم تحضيرها في الليلة السابقة. بعد وضع الدورق في المحضنة، قم بتشغيل جهاز spectrophotometer واضبطه لقراءة الامتصاصية عند 600 nanometers. وفي هذه الأثناء، أخرج لوحة microtiter من درجة حرارة 4 °C وأزل الغشاء البلاستيكي. قم بإزالة أي بروتين غير مرتبط من اللوحة عن طريق الغسل 10 مرات باستخدام 200 microliters لكل بئر من محلول tris buffered saline أو TBS بتركيز 1X وبقيمة pH 7.5، مع طرق اللوحة مقلوبة على مناديل ورقية بين عمليات الغسل.

يُجرى الحجب بإضافة 200 µL من كاشف الحجب بنسبة 5% في TBS لكل بئر لمدة ساعة واحدة. مع تغليف الصفيحة بغلاف بلاستيكي، يُغسل محلول الحجب 10 مرات باستخدام 200 µL من 1X TBS-T، مع طرق الصفيحة مقلوبة على أربع طبقات من الورق المناشف بين كل غسلة وأخرى.

من هنا، استخدم رؤوس ماصات ذات مرشح حاجز لتجنب التلوث الخلطي بالعاثلات. انقل 100 µL من مكتبة العاثلات إلى البروتينات. أغلق الطبق مرة أخرى بغطاء بلاستيكي واحضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

عند نهاية الساعة الواحدة، قم بإزالة الغشاء البلاستيكي من الطبق واغسله فوراً عن طريق هز العاثية (phage) في نفايات المواد البيولوجية الخطرة. بعد ذلك، استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 200 µL من محلول 1X TBST بسرعة إلى كل بئر. اضبط المؤقت لمدة دقيقة واحدة.

بعد مرور دقيقة واحدة، قم بتفريغ المحلول المنظم في حاوية النفايات البيولوجية الخطرة، ثم اطرق الطبق مقلوباً على منشفة ورقية وضعه مرة أخرى على طاولة المختبر. كرر خطوات الغسيل 10 مرات، وبعد الغسلة العاشرة، خذ 200 µL من خلايا BLT 5 4 0 3 من أنبوب فالكون سعة 50 mL عند درجة حرارة 4 °C وانقلها إلى قاع كل بئر من الآبار التسعة التي تم تفريغ الغسلة الأخيرة منها.

غلف الأطباق بغلاف بلاستيكي وضعها عند 37 degrees Celsius لمدة 20 دقيقة، وذلك للسماح لأي عاثية لا تزال ملتصقة بالطعم بإصابة البكتيريا بنهاية الـ 20 دقيقة. انزع الغلاف عن الأطباق. بعد ذلك، اسحب 10 µL من البكتيريا من بئر التكرار واحد في BSA عند 25 degrees Celsius وانقلها إلى 990 µL من الوسط المسمى "واحد".

كرر هذه العملية مرتين إضافيتين لهذا البئر، مما ينتج عنه ثلاث مكررات من تخفيف 1 إلى 100 للفاج من ذلك البئر؛ وهذا يمثل التكرار الأول لـ BSA الذي تم أخذ عينات منه ثلاث مرات. ستُستخدم هذه التخفيفات لتقدير متوسط العيار (titer) زائد أو ناقص الخطأ المعياري للمتوسط لذلك التكرار من BSA. قم بتنفيذ الشيء نفسه للتكرار الثاني والثالث لـ BSA، وللبثور الثلاث المكررة لبروتين الطعم المسموم (poisoned bait protein) ولبروتين الطعم (bait protein). ضع هذه الأنابيب الـ 27 من EOR جانباً. إذا كانت البكتيريا في القارورة عند كثافة ضوئية تتراوح من 0.6 إلى 1.0، فقم بصب 50 milliliters من الخلايا من قارورة fern في كل من قوارير إرلنماير الـ 9 سعة 250 milliliter.

خذ الـ 170 µL المتبقية من بكتيريا BLT 5 4 0 3 المصابة بالعاثيات من بئر التضاعف الأول لـ BSA وأضفها إلى الـ 50 mL من الخلايا المحددة بـ BSA rep.One. كرر هذه العملية لجميع الآبار التسعة قبل رج القوارير في الحاضنة عند درجة حرارة 37 °C. وفي هذه الأثناء، قم بإجراء تخفيفات من التخفيفات الـ 27 الأولية عن طريق أخذ 100 µL من وسط LB المحتوي على البكتيريا من أنبوب Einor رقم 1 وإضافتها إلى 900 µL من وسط LB في أنبوب einor.

بالنسبة للتخفيف 10⁻³، تخلص من طرف الماصة ذي الحاجز المرشح واستبدله بآخر جديد قبل سحب 100 µL من وسط LB الذي يحتوي على البكتيريا من الأنبوب رقم 4 وإضافتها إلى 900 µL من وسط LB في أنبوب efp. وبالنسبة للتخفيف 10⁻⁴، استمر في عملية التخفيف لجميع المكررات الثلاثة لكل التكرارات من جميع البروتينات والمعالجات. يجب أن يكون المجموع 135 أنبوباً بمجرد تحلل الخلايا.

اجعل تركيز كلوريد الصوديوم في المزرعة 0.5 molar عن طريق إضافة خمسة milliliters من مخزون كلوريد الصوديوم بتركيز خمسة molar، ثم انقل العينة إلى زجاجة طرد مركزي مُصنفة، واطردها مركزيًا بسرعة 8,000 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة أربع درجة Celsius. بعد ذلك، اسكب الطافي الذي يحتوي على الفيروس في أنبوب falcon سعة 50 milliliter نظيف ومعقم. أضف بضع قطرات من الكلوروفورم إلى الطافي المسكوب في أنبوب Falcon.

يمكن تخزين الطافي عند درجة حرارة 4 °C لجولة اختيار الألفة التالية في اليوم الثالث، اسحب بواسطة الماصة 250 µL من خلايا VLT 5 4 0 3 من درجة حرارة 4 °C في كل أنبوب من أنابيب اختبار البوروسيليكات المرقمة والمجهزة مسبقاً. بعد ذلك، اسحب 100 µL من التخفيف في أنبوب einor 1 إلى 250 µL من الخلايا في أنبوب اختبار البوروسيليكات رقم 1. قم بتسخين الخمس بوصات الأولى من الماصة لفترة وجيزة فوق اللهب ثم اغمسها في molten top aros المصهور.

اسحب ثلاث milliliters وأضفها بسرعة إلى أنبوب الاختبار فوق الخلايا والعاثيات. اخلط المزيج عن طريق نقر الأنبوب بالإصبع مع إمساكه باليد الأخرى، ثم صب المحتويات على الطبق. أمل الطبق واستخدم أنبوب الاختبار لدفع الفقاعات والبقع الجافة حتى يتغطى الطبق بالكامل بطبقة الـ agros العلوية.

اتركه قائماً على طاولة المختبر ليبرد. تخلص من أنبوب البوروسيليكات. تخلص من طرف الماصة ذو الحاجز المرشح واستخدم طرفاً جديداً، وتابع العملية حتى يتم زرع جميع التخفيفات في الأطباق.

استخرج الأطباق المُحضرة من الحاضنة تدريجياً مع استهلاكها، على ألا يتجاوز عددها ستة أطباق في المرة الواحدة لتجنب تبردها وتصلب طبقة الأجار العلوية بسرعة كبيرة، ثم افحص اللويحات المتكونة على الأطباق وتخلص من تلك التي تظهر تحللاً تاماً (confluent lysis). حدد أي من التخفيفات التسلسلية المتبقية أنتجت عدداً قليلاً بما يكفي من اللويحات للسماح بإجراء حساب دقيق. سجل عدد اللويحات من هذه الأطباق ثم ابدأ بحساب العيار (titer) كما هو موضح في البروتوكول النصي في نهاية عملية الاختيار بالالفة. رابعاً، اختر 18 مستعمرة لويحية منفردة ومحددة جيداً باستخدام طرف ماصة أصفر معقم.

قم بترطيب الجزء الداخلي من الرأس باستخدام tris hydrochloride pH 8.5 في أنبوب einor. بعد ذلك، استخرج لُباب هذه اللويحات من أطباق التعيير عن طريق دفع الرأس عبر لويحة معزولة جيداً وصولاً إلى طبق Petri البلاستيكي الموجود بالأسفل وشفط اللُباب، ثم قم بتفريغ اللُباب في 100 µL من tris hydrochloride pH 8.5 في الأنبوب المناسب قبل استخدام جهاز vortex. وباختصار، قم بتسخين 20 µL من هذا الحجم عند 65 °C لمدة 10 دقائق، ثم تابع عملية PCR والتسلسل كما هو موضح في البروتوكول النصي؛ وما يظهر هنا هو نتائج تعيير نموذجية من خلال أخذ العينات عدة مرات، حيث أن التقديرات النهائية الإجمالية تكون أقل عرضة لأخطاء الماصة، مما يعطي تقديراً أكثر دقة للتعيير الفعلي والتباين المحيط به.

يتم الحصول على تقديرات من بئر إلى آخر تظهر زيادة في عيار العاثيات (phage titer) بشكل تفضيلي في الطعم غير المسموم مع زيادة عدد جولات الاختيار التقاربي. يوفر هذا أيضًا ثقة في أن التقنية تعمل بشكل صحيح. كما يعد الاحتفاظ بنسبة متزايدة من العاثيات التي تحتوي على القطعة المدرجة (insert) في آبار الطعم غير المسموم مع زيادة عدد جولات الاختيار التقاربي أمرًا مبشرًا بعد جولات الاختيار التقاربي المتقدمة.

تعد الزيادة في عدد الفاجات المستعادة بشكل مستقل والتي تحتوي على قطعة مدرجة مقارنة بالجولة الأولى، واستقرار هذه التضاعفات في عدد قليل من الحزم ذات الأحجام المتماثلة، مؤشراً جيداً على أنه يتم اختيار مستنسخات معينة في عملية الاختيار بالألفة التي تتبع هذا الإجراء. ويمكن تنفيذ طرق أخرى مثل نظام الهجين الثنائي من الخميرة (yeast two hybrid) من أجل التحقق من التفاعلات التي تم اكتشافها بواسطة عرض الفاجات.