بروتوكول لفج العرض وتقارب اختيار طريق الطعوم البروتين المؤتلف
فبراير 16, 2014
عرض فج هي تقنية قوية لالتقاط البروتينات أو الأنصاف البروتين الذي يتفاعل مع جزيء يجمد الفائدة. مرة واحدة وقد تم اتخاذ قرار من هذا النوع من مكتبة [كدنا] فج لخلق والشاشة، وبروتوكول الموصوفة هنا يسمح اختيار تقارب كفاءة مما يؤدي إلى تحديد interactors.
الهدف العام من هذا الإجراء هو اكتشاف تفاعلات البروتين مع جزيئات الطعم الثابتة. يتم تحقيق ذلك عن طريق الحصول على الطعم أولا وشل حركته. الخطوة الثانية هي إدخال مكتبة العاثيات ليتم فحصها إلى الطعم في ظل ظروف تعزز الربط.
بعد ذلك ، تتم إزالة العاثية غير المنضمة عن طريق الغسيل الصارم. بينما تستخدم العاثيات المقيدة لإصابة البكتيريا قبل التعافي. الخطوة الأخيرة هي تضخيم العاثية المرتبطة للتكرار التالي لاختيار التقارب.
في النهاية ، عندما تكون هضاب عيار العاثيات ، يتم اختيار اللويحات المفردة وتسلسلها لإظهار البروتينات التي لها أعلى تقارب مع التأخر الثابت في ظل ظروف الربط التجريبية. يمكن أن تساعد هذه العملية في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في تفاعلات بروتين البروتين. يبدأ هذا الإجراء بوضع البروتين المؤتلف المنقى في قاع ألواح الميكروتيتر كما هو موضح في بروتوكول النص.
تتمثل الخطوة التالية في تلقيح 50 مل من وسط لوريا بوراني ب 100 ميكروغرام لكل مليلتر من الأمبيسلين في قارورة إرلينماير سعة 250 مليلتر مع مستعمرة واحدة تم زراعتها مسبقا كما هو موضح في بروتوكول النص ، واحتضان عند 37 درجة مئوية ، 200 دورة في الدقيقة في شاكر أفقي واستخدام مقياس الطيف الضوئي لمراقبة كثافة الخلية حتى يتم الحصول على كثافة بصرية عند 600 نانومتر من 0.5 إلى 0.6. ثم صب الخلايا في أنبوب فالكون سعة 50 مل أو ما شابه ذلك واحتفظ بها عند أربع درجات مئوية حتى تظل الخلايا المستخدمة عادة قابلة للحياة لمدة أسبوع تقريبا في اليوم الأول. استعد لاختيار التقارب كما هو موضح في بروتوكول النص في صباح اليوم الثاني.
ضع تسعة قوارير أوتوكلاف فارغة سعة 250 ملليلتر من إرلينماير في مشابك شاكر الحضانة ، وقم بتلقيح 500 مل من لال بوراني مع 500 ميكرولتر من إحدى الثقافات الليلية للعاثية المصابة ب BLT 5 4 0 3 خلايا بدأت في الليلة السابقة بعد وضع القارورة في الحاضنة ، وقم بتشغيل مقياس الطيف الضوئي واضبطه على قراءة الامتصاص عند 600 نانومتر. في هذه الأثناء ، قم بإزالة لوحة الميكروتيتر من أربع درجات مئوية وانزع الفيلم البلاستيكي. قم بإزالة أي بروتين غير مرتبط من الطبق عن طريق الغسيل 10 مرات باستخدام 200 ميكرولتر لكل بئر من محلول ملحي مخزن X tris أو TBS pH 7.5 وضرب الطبق رأسا على عقب على المنشفة الورقية بين الغسل.
كتلة مع 200 ميكرولتر لكل بئر من كاشف مانع 5٪ في TBS لمدة ساعة واحدة. مع لف اللوحة بغلاف بلاستيكي ، اغسل محلول الحجب 10 مرات باستخدام 200 ميكرولتر من X-T-B-S-T الذي يضرب اللوحة رأسا على عقب على أربع طبقات من الورق. منشفة بين الغسل.
من هنا ، استخدم أطراف حاجز المرشح لتجنب التلوث المتبادل للعاثيات. ماصة 100 ميكرولتر من مكتبة العاثيات مع البروتينات. أعد إغلاق اللوحة بغلاف بلاستيكي واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
في نهاية ساعة واحدة ، قم بإزالة الغلاف البلاستيكي من اللوحة واغسله على الفور عن طريق هز العاثية في النفايات الخطرة بيولوجيا. ثم استخدم ماصة متعددة لإضافة 200 ميكرولتر بسرعة من X-T-B-S-T إلى كل منها. حسنا ، اضبط مؤقتا لمدة دقيقة واحدة.
بعد دقيقة واحدة ، قم بهز المخزن المؤقت في النفايات الخطرة بيولوجيا ، واضرب اللوحة رأسا على عقب على منشفة ورقية وضعها مرة أخرى على المقعد. كرر خطوات الغسيل 10 مرات بعد الغسيل العاشر. خذ 200 ميكرولتر من BLT 5 4 0 3 خلايا من أنبوب الصقر سعة 50 مليلتر عند أربع درجات مئوية وانقلها إلى قاع كل من الآبار التسعة التي تمت إزالة الغسيل الأخير منها.
لف الأطباق في غلاف بلاستيكي وضعها على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة للحصول على أي عاثية لا تزال عالقة في الطعم لإصابة البكتيريا في نهاية 20 دقيقة. قم بفك اللوحات. بعد ذلك ، قم بإزالة 10 ميكرولترات من البكتيريا من BSA عند 25 درجة مئوية ، بئر واحد وقم بنقلها إلى 990 ميكرولتر من متوسط العلامة.
كرر هذه العملية مرتين أخريين لهذا البئر مما ينتج عنه ثلاث نسخ من واحد إلى 100 ديلو من العاثية من ذلك البئر ، وهذا هو تكرار BSA ، تم أخذ عينات منه ثلاث مرات. سيتم استخدام هذا التخفيف لتقدير متوسط العيار زائد أو ناقص الخطأ المعياري لمتوسط هذا النسخ المتماثل ل BSA يفعل الشيء نفسه للنسخ المتماثل الثاني والثالث من BSA للآبار الثلاثة المكررة لبروتين الطعم المسموم وبالنسبة لبروتين الطعم ، ضع هذه الأنابيب ال 27 EOR جانبا. إذا كانت البكتيريا الموجودة في القارورة بكثافة بصرية تتراوح من 0.6 إلى 1.0 ، فقم بصب 50 مل من الخلايا من قارورة السرخس في كل من قوارير إرلينماير سعة 9 250 ملليلترا.
خذ 170 ميكرولترا المتبقية من العاثيات المصابة BLT 5 4 0 3 البكتيريا في تكرار BSA بئر واحد وأضفها إلى 50 مل من الخلايا التي تحمل علامة BSA rep. واحد. افعل ذلك لجميع الآبار التسعة قبل هز القوارير في حاضنة 37 درجة مئوية. وفي الوقت نفسه ، قم بإجراء التخفيفات من التخفيفات الأولية ال 27 عن طريق أخذ 100 ميكرولتر من LB مع البكتيريا من أنبوب Einor الأول وإضافته إلى 900 ميكرولتر من LB في أنبوب einor.
أربعة من أجل التخفيف من 10 إلى ناقص الثالث ، تخلص من طرف حاجز المرشح للحصول على طرف جديد قبل الحصول على 100 ميكرولتر من LB مع البكتيريا من أنبوب einor أربعة وإضافته إلى 900 ميكرولتر من LB في أنبوب eph. سبعة للتخفيف من 10 إلى ناقص الرابع ، استمر في التخفيف لجميع النسخ الثلاثية لجميع النسخ المتماثلة لجميع البروتينات والعلاجات. يجب أن يكون هناك 135 أنبوبا في المجموع بمجرد أن تكذب الخلايا.
ارفع المزرعة إلى 0.5 مولي كلوريد الصوديوم عن طريق إضافة خمسة ملليلتر من مخزون كلوريد الصوديوم بخمسة مولات ونقل العينة إلى جهاز طرد مركزي لزجاجة طرد مركزي تحمل علامة 8,000 مرة جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم صب المادة الطافية التي تحتوي على الفيروس في أنبوب صقر نظيف ومعقم سعة 50 مل. أضف بضع قطرات من الكلوروفورم إلى المادة المطفية المصبوبة في أنبوب الصقر.
يمكن تخزين المادة الطافية عند أربع درجات مئوية للجولة التالية من اختيار التقارب في اليوم الثالث ، ماصة 250 ميكرولتر من VLT 5 4 0 3 خلايا من أربع درجات مئوية في كل من أنابيب اختبار سيليكات بو المرقمة المعدة مسبقا. ثم ماصة 100 ميكرولتر من التخفيف في أنبوب einor واحد إلى 250 ميكرولتر من الخلايا في أنبوب اختبار سيليكات bur. واحد. قم بتسخين أول خمس بوصات من الماصة لفترة وجيزة فوق اللهب واغمرها في الجزء العلوي المنصهر.
اسحب ثلاثة ملليلتر وقم بتسليمها بسرعة إلى أنبوب الاختبار أعلى الخلايا والعاثية. امزج عن طريق النقر بإصبعك أثناء إمساك الأنبوب باليد الأخرى ، ثم صب المحتويات على الطبق. قم بإمالة اللوحة واستخدم أنبوب الاختبار لمطاردة الفقاعات والبقع الجافة حتى يتم تغطية اللوحة بأكملها بواسطة agros العلوي.
ضعه جانبا في وضع مستقيم على المقعد ليبرد. تخلص من أنبوب سيليكات البوروس. أخرج طرف حاجز الفلتر واحصل على طرف جديد واستمر حتى يتم طلاء كل التخفيف.
استرجع الأطباق المحضرة من الحاضنة أثناء نضبها ، ولكن ليس أكثر من ستة في المرة الواحدة أو تبرد وتتصلب الألواح العلوية بسرعة كبيرة ، وافحص البلاك المتشكل على الألواح وتخلص من تلك التي تحتوي على تحلل متقارب. حدد أي من التخفيفات التسلسلية المتبقية أنتجت عددا قليلا من اللويحات بما يكفي لتمكين تسجيل دقيق لعدد البلاك من هذه اللوحات وتابع حساب العيار كما هو موضح في بروتوكول النص في نهاية اختيار التقارب. في الجولة الرابعة، حدد 18 مستعمرة فردية محددة جيدا باستخدام طرف ماصة صفراء معقمة.
بلل الجزء الداخلي من الطرف بدرجة حموضة هيدروكلوريد تريس 8.5 في أنبوب إينور. ثم قم بتدوير هذه اللويحات من ألواح النعش عن طريق دفع الطرف من خلال لوحة معزولة جيدا مباشرة إلى طبق بتري البلاستيكي أدناه وشفط اللب ، وطرد اللب إلى 100 ميكرولتر من تريس هيدروكلوريد درجة الحموضة 8.5 في الأنبوب المناسب قبل الدوامة. باختصار ، قم بتسخين 20 ميكرولترا من هذا الحجم عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق واستمر في تفاعل البوليميراز المتسلسل والتسلسل كما هو موضح في بروتوكول النص الموضح هنا هي نتائج عيار نموذجية عن طريق أخذ العينات عدة مرات ، وتكون الأرقام النهائية المقدرة ليست عرضة لأخطاء سحب العينات وتقدير أكثر دقة للعيار الفعلي والاختلاف حول هذا.
يتمالحصول على تقدير جيد إلى جيد زيادة عيار العاثية بشكل تفضيلي للطعم غير المسموم مع زيادة عدد جولات اختيار التقارب. يوفر أيضا الثقة في أن التقنية تعمل. كما أن الاحتفاظ بنسبة متزايدة من العاثيات التي تحتوي على إدراج في آبار الطعم غير المسمومة مع زيادة عدد اختيارات التقارب أمر ميمون أيضا بعد جولات متقدمة من اختيار التقارب.
تعد الزيادة في عدد العاثيات المستردة بشكل مستقل والتي تم إدخالها بالنسبة للجولة الأولى واستقرار هذه الأمبليكونات على عدد قليل من النطاقات المتطابقة الحجم مؤشرا جيدا على أنه يتم اختيار نسخ معينة في اختيار التقارب باتباع هذا الإجراء. يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل سهولة هجينين من أجل التحقق من صحة التفاعلات التي تم اكتشافها بواسطة عرض العاثيات.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تصف هذه المقالة تقنية عرض العاثيات المستخدمة لتحديد تفاعلات البروتين مع جزيئات الطُعم المثبتة. يسمح البروتوكول باختيار الروابط الفعال وتحديد المتفاعلين.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- تفاعلات البروتين
- تقنية عرض العاثيات
- اختيار الروابط
الخلفية
- عرض العاثيات هي طريقة لدراسة تفاعلات البروتين.
- تتضمن استخدام مكتبة الحمض النووي المكمل.
- جزيئات الطُعم المثبتة ضرورية للعملية.
- تسمح التقنية بتحديد المتفاعلين المحددين.
هدف الدراسة
- لاكتشاف تفاعلات البروتين مع جزيئات الطُعم المثبتة.
- لتوفير بروتوكول مفصل لعرض العاثيات.
- لتعزيز كفاءة اختيار الروابط.
الطرق المستخدمة
- اكتساب وتثبيط جزيئات الطُعم.
- إدخال مكتبة العاثيات إلى الطُعم.
- غسل شديد لإزالة العاثيات غير المرتبطة.
- إصابة البكتيريا بالعاثيات المرتبطة للتعافي.
النتائج الرئيسية
- تحديد ناجح للمتفاعلين البروتينيين.
- تضخيم فعال للعاثيات المرتبطة.
- تبيان فعالية البروتوكول.
- تطبيقات محتملة في مختلف الدراسات البيولوجية.
الاستنتاجات
- عرض العاثيات هو أداة قيّمة لدراسة تفاعلات البروتين.
- البروتكول الموصوف يعزز عملية التحديد.
- يمكن للبحث الإضافي توسيع تطبيقاتها في علم الأحياء.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Phage display enables high-confidence identification of protein-protein interactions through iterative affinity selection and titer monitoring, supporting target validation in early discovery. By requiring independent clone recovery and amplicon consistency, the method reduces false positives and increases predictive confidence in bait interactors. This workflow informs lead identification by prioritizing targets with reproducible binding evidence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying proteins that consistently bind immobilized bait under stringent conditions.
- Operational Value: Supports biological de-risking through replicate screening and titer progression tracking to distinguish specific from nonspecific binding.
- Predictive Value: Increasing phage titer and insert retention across rounds provide quantitative evidence for target engagement strength and specificity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated phage libraries for downstream screening by enriching for high-affinity binders through controlled washing and amplification steps.
- Reproducibility: Monitoring phage titer after each selection round provides a quantifiable metric to assess selection efficacy and control consistency across replicates.
- Scalability: The protocol accommodates multiple baits in parallel using microtiter plates, enabling medium-throughput interaction profiling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Confirmed interactors from phage display can be forwarded to orthogonal validation (e.g., co-IP, yeast two-hybrid) to support preclinical target assessment.
- Mechanistic De-risking: Isolation of independent plaques and sequencing of amplicons helps confirm that observed binding reflects specific protein-protein interactions rather than artifacts.
- Risk-Adjusted Advancement: The settling of amplicons on identically sized bands after multiple rounds signals clonal enrichment, supporting go/no-go decisions in target prioritization.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target engagement screening to lead identification, providing biochemical evidence to inform downstream validation efforts.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about protein interactions by selecting for phage encoding proteins that bind bait under defined conditions.
- Screening: Generates enriched phage pools suitable for further characterization through iterative binding and amplification.
- Analytics: Titer measurements and amplicon analysis enable quantitative assessment of selection progress and clone enrichment.
- Translational Research: Identified interactors serve as candidates for functional validation in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: The standardized workflow can be applied across multiple baits and targets, supporting platform reuse in interaction discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by requiring reproducible recovery of independent clones presenting the same protein.
- Operational Value: Employs standardized washing, blocking, and infection steps to minimize variability and cross-contamination.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by filtering out nonspecific binders early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization of targets based on binding consistency and enrichment metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology techniques including phage handling, bacterial culture, and nucleic acid manipulation.
- Depends on access to incubators, shakers, spectrophotometers, and centrifugation equipment for titer determination.
- Necessitates standardized reagent preparation (e.g., TBS, blocking agents) and strict adherence to washing protocols to control background.
- Involves adaptation considerations when using non-protein baits, as blocking and washing conditions may require optimization.
- Practical limitations include the time required for multiple affinity selection rounds and the need for careful plaque picking to avoid confluent lysis.
