تحجيم إنتاجية عالية التحديد من المكتبات الأجسام المضادة الاصطناعية-عرض فاجي

الهدف العام من هذا الإجراء القابل للتطوير هو عزل استنساخ العاثيات المحددة وعالية التقارب من مكتبة العاثيات المعروضة باستخدام نهج إنتاجية عالية يتيح الاختيار المتوازي مقابل مئات المجالات المستهدفة المستضدية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تثبيت المجالات المستضدية المنقاة أولا في ألواح الآبار الصغيرة. تتمثل الخطوات التالية في تعريض واستنساخ العاثيات الرائعة والتقاطها وإطلاقها وتضخيمها والتي ترتبط على وجه التحديد بمستضد الجمود المجهري في جولات متتالية من الاختيار.

خلال هذه العملية ، تتم مراقبة فعالية الاختيار باستخدام طرق مجمعة في كل خطوة. تتمثل الخطوة الأخيرة في تقييم خصوصية وصلة و / أو نشاط المستنسخة المعزولة. في النهاية ، يتم عزل شظايا محددة عالية التقارب ضد أعداد كبيرة من المستضدات بالتوازي ، مما يتيح توليد الأجسام المضادة المفيدة في تحليل فئات كاملة من البروتينات ذات الصلة هيكليا أو وظيفيا.

تكمن أهمية هذه الطريقة في أنها توفر بديلا يمكن أن يساعد في التغلب على القيود وتسريع وتيرة تقنيات تطوير الأجسام المضادة التقليدية في المختبر الأكاديمي أو الصناعي. تشمل الميزة الرئيسية لهذه التقنية على تقنيات تطوير الأجسام المضادة التقليدية مثل الورم الهجين أنها لا تتطلب استخدام. يمكن استخدامه لأي بروتين تقريبا ، بما في ذلك البروتينات السامة وغير المناعية.

كما سنرى ، يمكن موازاته بسهولة وينتج عنه في النهاية حمض نووي مؤتلف متجدد يشفر جسما مضادا عالي التقارب خاص بمستضد معين ومقايسات مناعية وظيفية وقياسية في أقل من ستة إلى ثمانية أسابيع. نظرا لأهمية الأجسام المضادة في البحث في الطب الحيوي ، رأينا فرصة لتكييف وتوسيع نطاق توليد المستضد واختيار الأجسام المضادة وتحديدها لنهج عالي الإنتاجية مع الحفاظ على إمكانية الوصول إلى المختبرات التي تتراوح من حيث الحجم والموارد المتاحة. في صباح يوم اختيار العاثيات ، اختر مستعمرة واحدة من T واحدة خلايا القولونية المقاومة للعاثيات.

أضفه إلى مليلتر من اثنين من وسائط yt مع التتراسيكلين بمعدل 50 ميكروغرام لكل ملليلتر. دع المستعمرة تحتضن الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة في شاكر مداري يبلغ طوله 2.5 سم. بمجرد أن يصبح نمو الثقافة واضحا بصريا ، انقل الخلايا إلى الحجم المطلوب من الوسائط المكملة بالتتراسيكلين.

يجب أن يكون هناك ما يكفي ل 100 ميكرولتر لكل اختيار جيد ، أو حوالي 10 مل لكل 96. تقوم لوحة البئر بتوسيع حصة الثقافة إلى كل من البنسلين الكربوني والوسائط المكملة بالكانين. تضمن هذه الثقافات عدم حدوث عدوى مسبقة في الخلايا لاستخدامها في التضخيم.

عندما يصل الامتصاص البصري للثقافة إلى 0.4 إلى 0.8 عند 595 نانومتر. بعد خمس إلى سبع ساعات ، تكون الخلايا جاهزة للتطبيق على ألواح المستضد. لكي يضمن هذا البروتوكول التغطية المطلوبة للمكتبة ، قم بإعداد لوحات مستضد مكررة كافية وألواح بروتين تحكم غير محددة.

يتم توفير تفاصيل الحساب المعروضة في بروتوكول النص. بعد تثبيت بروتينات التحكم المستهدفة وغير المحددة طوال الليل ، قم بإزالة محلول البروتين من اللوحة. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب وقم بحظر لمدة ساعة واحدة مع الرج وغسل اللوحة أربع مرات قبل إضافة مكتبة العاثيات أثناء نمو الخلايا.

في يوم اختيار العاثيات ، نقوم بمسح العاثية غير المحددة أو الخاصة بالعلامة التي تم عرضها استنساخ FAB من المكتبة عن طريق نقل 100 ميكرولتر من مكتبة العاثيات إلى لوحات التحديد السلبية لإضافة التحديد السلبي. قم بإزالة عاثية ربط العلامة عن طريق إضافة فائض من علامة التقارب القابلة للذوبان. للقيام بذلك ، أضف تركيزا نهائيا 10 ميكرومولار من ضريبة السلع والخدمات القابلة للذوبان لكل منهما.

حسنا ، ثم احتضان الألواح لمدة ساعة إلى ساعتين على شاكر في درجة حرارة الغرفة. لتحضير محلول البروتين المستهدف من اللوحة ، أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع والكتلة لمدة ساعة واحدة مع الرج واغسلها أربع مرات قبل إضافة مكتبة العاثيات. بعد الحضانة ، اجمع عاثية snat من اللوحات.

باستخدام معالج سائل 96 قناة ، انقل العاثية إلى ألواح مطلية بالمستضد. ثم احتضان الألواح لمدة ساعة إلى ساعتين على شاكر في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، قم بإزالة العاثية غير المنضمة عن طريق غسل الآبار من ثماني إلى 15 مرة باستخدام عازلة PT.

يمكن القيام بذلك يدويا أو باستخدام غسالة الألواح الأوتوماتيكية. ثم قبل إضافة الخلايا مباشرة ، قم بإزالة كل مخزن الغسيل الزائد عندما تكون الخلايا وألواح المستضد جاهزة. قم بتخطيب العاثية بإضافة 100 ميكرولتر من الخلايا النامية إلى كل بئر واترك الصفائح تحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة نصف ساعة.

لا يتوقع أن تؤدي الجولات القليلة الأولى من الانتقاء إلى تخصيب كبير ، ولكن القياس الكمي لعيارات العاثيات الناتجة يمكن أن يضمن وهم الحد الأدنى من تركيزات العاثيات اللازمة للاختيارات الناجحة. للقيام بذلك ، يمكن إزالة كمية من الخلايا قبل إضافة العاثية المساعدة من أجل إحكام إخراج العاثية عن طريق تحضير وتصفيح التخفيفات التسلسلية للخلايا على ألواح أجار مكملة بالمضادات الحيوية. بعد الحضانة لمدة نصف ساعة ، أضف M 13 K oh سبعة عاثيات مساعدة إلى كل بئر بتركيز 10 مليارات وحدة تشكيل مستعمرة لكل مليلتر.

دع الألواح تحتضن 45 دقيقة أخرى هذه المرة مع الاهتزاز بسرعة 200 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، انقل الخلايا إلى كتلة بئر عميقة 96 بئر مع قاع V يحتوي على 1.2 مل من وسائط YT المكملة لكل بئر. دع ألواح الآبار العميقة تحتضن عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة في اليوم التالي.

بيليه البكتيريا عن طريق تدوير الألواح عند 4 ، 000 GS لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. ثم من كل لوحة مكررة ، انقل كميات متساوية من المادة الطافية التي تحتوي على العاثية إلى أنبوب صغير. 96 جيدا صندوق أزرق دقيق لاستخدامه كمدخلات لجولات الاختيار اللاحقة للعاثية المجمعة ، أضف حجما واحدا 10 من 10 XPBT واخلطه لتحييده.

الآن ، كرر عملية الاختيار من المكتبة. التصفية المسبقة وحضانة العاثية المستضد ثلاث إلى أربع مرات باستخدام العاثية المضخمة من الجولة السابقة من الاختيار. افعل ذلك حتى يتم ملاحظة إثراء ربط الهدف مقارنة بربط بروتينات التحكم غير المحددة بواسطة ألواح Eliza Micro well المشفرة بميكروغرامين لكل مليلتر من مستضد أو بروتين تحكم كما هو موضح سابقا في المكتبة قبل التخليص وحضانة العاثية المستضد ثم يتم حظرها وغسلها كما كان من قبل للمستضد المحظور والمغسول وألواح الطلاء بالبروتين التابع للتحكم ، ضع 100 ميكرولتر من العاثية المخففة على الآبار واترك الألواح تحتضن مع الاهتزاز من أجل 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعد الحضانة ، اغسل الأطباق ثماني مرات باستخدام عازلة PT.

ثم بعد الغسيل ، أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد M 13 HRP بدرجة واحدة إلى 5،000 لوشن في PBT إلى كل بئر حاضن لمدة نصف ساعة للسماح بارتباط الجسم المضاد بالعاثية المرتبطة بالمستضد. ثم اغسل الألواح باستخدام عازلة PT ست مرات ومرتين أخريين باستخدام PBS مستقيم ، قم بإعداد وخلط وتطبيق 100 ميكرولتر من ركيزة TMB واحدة إلى واحدة على كل بئر. دع هذا يتفاعل لمدة خمس إلى 15 دقيقة ، مع إيقاف التفاعلات عندما يكون هناك تغير كبير في اللون.

أوقف التفاعلات بإضافة 100 ميكرولتر من حمض الفوسفوريك المولاري. اقرأ الآن الامتصاص في الآبار عند 450 نانومتر وقارن إشارات الربط المستهدفة بإشارات الربط لبروتينات التحكم بعد التخصيب. يمكن عزل المستنسخة الفردية وتمييزها بتسلسل العاثية ، وتحويل الحمض النووي للعاثية المرتبطة ب fab الحرة ، وتقييم الارتباط المباشر بالهدف باستخدام FabuLisa النسيلي كما هو موضح في الجزء النصي من البروتوكول.

بالنسبة للمختبرات التي تتطلب إنتاجية أعلى ، يمكن توسيع نطاق هذه المنهجية وأتمتتها. مع وضع هذا الهدف في الاعتبار ، تم تطوير الروبوتات المخصصة التي يمكنها توسيع قدرة الاختيار من خلال أتمتة جميع جوانب الإجراء ، بما في ذلك الحجب ، والعاثية ، والربط ، و elucian والمزيد. تتمثل إحدى طرق الحصول على المستضد لاستخدامه في اختيارات الأجسام المضادة في استخدام تقنيات الجينات الاصطناعية للحصول على تركيبات للتعبير عن مجالات البروتين المعزولة.

في معظم الحالات ، يتيح ذلك التعبير عن الإنتاجية العالية وعزل كميات كافية من المستضد النقي النقي بما فيه الكفاية للاختيار. خلال الجولات المتتالية من عملية الاختيار ، تمت مراقبة تركيزات العاثيات المراوغة وإثراء العاثية المرتبطة على وجه التحديد بالمستضد إما عن طريق معايرة العاثيات كما هو موضح سابقا أو مراقبتها باستخدام تجمعات العاثيات. في اختبار ELA ، تشير نسبة الربط الأكبر من اثنين بشكل عام إلى وجود نسخ ربط محددة.

على العكس من ذلك ، يمكن أن تساعد النسبة المنخفضة في تحديد سبب فشل التحديد. يتيح توصيف ربط الاستنساخ باستخدام الفحص الأميني اللوني مقارنة ربط العاثية أو الفاب بالمستضد الثابت مقارنة ببروتين التحكم السلبي المرتبط ، مما ينتج عنه مقياس للخصوصية عند تحجيم وأتمتة التحديدات باستخدام وحدات معالجة السوائل الآلية. يمكن أن يساعد استخدام الكروموفورات الممتصة في اكتشاف متى تكون قنوات معينة في السوائل إما مسدودة أو فقدت ختمها ، مما يؤدي إلى توصيل الحجم الجزئي ، والمساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها أثناء تحسين إجراءات الغسيل ، ويضمن استخدام المستنسخة الملزمة المعروفة الحفاظ على الارتباط المستهدف أثناء إزالة ربط الخلفية أثناء الغسيل.

بالإضافة إلى ذلك ، تضمن بروتوكولات إزالة التلوث الفعالة عدم وجود تلوث متبادل من جولات الاختيار المتتالية أو إجراءات الاختيار المختلفة ، ويوصى بمراجعة معلمات استكشاف الأخطاء وإصلاحها الإضافية في بروتوكول النص. من خلال توسيع نطاق هذه التقنية للتطبيق الصناعي ، نأمل في تمكين الباحثين من استكشاف فئات كاملة من البروتينات ذات الصلة الهيكلية أو الوظيفية من خلال تسريع اختيار وتحديد الأجسام المضادة المتجددة عالية التقارب مع الهدف النهائي المتمثل في تحقيق أقصى تغطية للبروتينات.