سريعة وفعالة الزرد التنميط الجيني باستخدام PCR عالية الدقة مع تحليل نذوب

الهدف العام من هذا الإجراء هو البحث بسرعة عن الأنماط الجينية أو الطفرات أو الجينات المعدلة وراثيا المختلفة في أسماك الزرد. يتم تحقيق ذلك عن طريق استخراج الحمض النووي أولا من المقاطع الرفيعة ثم تضخيم الحمض النووي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). الخطوة التالية هي تغيير طبيعة أمبليكونات تفاعل البوليميراز المتسلسل أثناء تسجيل منحنيات الذوبان ، والتي يتم تحليلها بواسطة البرنامج.

في النهاية ، تظهر النتائج منحنيات ذوبان مميزة لأنماط وراثية مختلفة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطريقة الحالية مثل حجم الرحلان الكهربائي للهلام PCR ، هي أنها حساسة لتغيرات النيوكليوتيدات المفردة ، والإدخال الصغير ، وجميع عمليات الحذف ، وهذه التقنية سريعة وموثوقة. على الرغم من أنه يمكن استخدام هذه التقنية لأسماك الحمار الوحشي بسرعة وفعالية ، إلا أنه يمكن أيضا تطبيقها على أنظمة أخرى وكائنات حية نموذجية ، بما في ذلك خطوط الخلايا والفئران الأخرى.

في يوم تحضير الحمض النووي ، أضف البروتيناز K الطازج إلى مخزن التحلل بتركيز ملليغرام واحد لكل مليلتر. يمكن جمع الأنسجة من سمكة بالغة باستخدام مشبك رفيع أو من سمكة جنينية. قم أولا بتخدير السمك في محلول تريكا.

انتظر حتى تتباطأ حركات الخياشيمية. ثم ضع السمكة على كومة من المناديل وشفرة حلاقة معقمة ، اقطع قطعة صغيرة من زعنفة الذيل بطول حوالي ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات. ضع السمك بسرعة في حوض مكتوب عليه بالماء العذب للتعافي.

التقط مشبك الزعنفة بطرف ماصة معقم وانقله إلى أنبوب مملوء ب 100 ميكرولتر من محلول تحلل الحمض النووي. تأكد من تسمية كل من خزان والأنبوب ، واحتضان جميع الأنسجة المجمعة لمدة أربع ساعات على الأقل وحتى بين عشية وضحاها عند 55 درجة مئوية بعد الحضانة. قم بتعطيل بروتين ACE K عن طريق تسخين الأنابيب عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

يجب استخدام هذه العينات لتفاعل البوليميراز المتسلسل على الفور ، ولكن يمكن أيضا تخزينها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في لوحة 96 أو 384 بئر لكل تفاعل. لا تجمع بين أكثر من ميكرولتر واحد من الحمض النووي للبالغين مع أربعة ميكرولترات من الماسح الضوئي.

مزيج رئيسي يحتوي على مسبار الفلورسنت والبادئات بتركيز نهائي من خمسة مولار بيكو لكل منهما. إذا كان الحمض النووي من جنين ، فاستخدم ما يصل إلى ثلاثة ميكرولترات. قم بتغطية التفاعلات ب 30 ميكرولتر من الزيت المعدني ثم قم بإغلاقها.

بعد ذلك ، قم بتغطية لوحة PCR المحملة بختم لاصق شفاف بصريا. الآن قم بتحسين ظروف ركوب الدراجات PCR. تبدأ مجموعة الشروط النموذجية بخمس دقائق من وقت الذوبان.

يتبع ذلك 30 دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل مع ذوبان عشر ثوان و 25 ثانية من وقت الركوع و 30 ثانية من الاستطالة. يجب أن ينتهي التفاعل بذوبان إضافي 32 ثم يبرد إلى 15 درجة مئوية. قم بتحليل لوحة PCR عن طريق وضعها في نظام تحليل الذوبان في البرنامج.

قم بإعداد درجة الحرارة وإنشاء ملف تخزين بيانات جديد. قم بإعداد مجموعة فرعية. حدد الآبار التي تحتوي على عينات في الجانب الأيسر السفلي من الشاشة.

حدد علامة التبويب الطبيعية للتخلص من متغيرات الفلورسنت. ضع الخط المزدوج المتوازي يدويا في مناطق الذوبان والذوبان وما بعد الذوبان وتطبيع إشارات الفلورسنت البريميل وما بعد الذوبان لجميع العينات إلى واحد وصفر على التوالي. بعد ذلك ، قم بتمييز الأنماط الجينية بناء على درجة حرارة انصهارها عن طريق تحديد التجميع أولا.

ثم حدد مجموعة تلقائية من قائمة التحديد القياسية. ضمن قسم التجميع ، حدد عادي أو مرتفع لملفات تعريف الذوبان ذات الانتقالات الفردية أو الانتقالات المتعددة على التوالي. وهي موجودة في قائمة تحديد الحساسية ضمن قسم التجميع.

حدد الآن مجموعات الحوسبة ضمن قسم التجميع ثم انتقل إلى قائمة الملفات وانقر فوق حفظ لحفظ النتائج. يمكن تنفيذ البروتوكول خلال يوم واحد أو فصله في خطوات على مدى عدة أيام. عند إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل ، تعتمد درجات حرارة ذوبان الأمبليكون على الحجم ومحتوى GC ، ولكن بشكل عام تكون درجات حرارة البداية والنهاية البالغة 60 درجة مئوية و 95 درجة مئوية مناسبة بمجرد إجراء الذوبان.

تحليل منحنيات الذوبان الفلورية عادة تطبيع تباين منحنيات العينة المختلفة باستخدام مناطق ما قبل الذوبان وبعده كمعايير. هذا يحسن مقارنة النتائج من العينات المختلفة التي يرتبط فيها تباين التألق بالاختلافات التجريبية الطفيفة. يجب وضع كل زوج من خطوط درجة الحرارة للتطبيع على بعد درجة مئوية واحدة تقريبا.

يمكن تمثيل البيانات بطريقتين من خلال رسم بياني يوضح ملفات ملفات ملفات تعريف منحنى الذوبان ، أو بواسطة رسم بياني يوضح مخطط فرق طرحي مقارنة بعينة مرجعية بعد تحليل HRMA يمكن اكتشاف الطفرات أو الجينات المعدلة وراثيا. لوحظت طفرتان مختلفتان في EIF اثنين من الجين B خمسة من خلال المنحنيات الحمراء والزرقاء. يتم تحديد هذه العينات الطافرة من خلال اختلافها الكبير في منحنى الذوبان أو الأشكال أو التغير في التألق عند مقارنتها بمنحنيات النوع البري القياسية.

يوضح هذا المثال لأربعة أنماط وراثية مختلفة في مجموعة واحدة من الأجنة قوة وحساسية الطريقة. بمجرد إتقان ، يمكن القيام بهذه التقنية في أقل من ثماني ساعات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء HRMA للفحص الفعال على نطاق واسع للأنماط الجينية لأسماك الزرد.