والتصور والتقدير الكمي للخلايا الوسيطة أديبوجينيك التمايز المحتملة مع علامة نسب المحددة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور وقياس تمايز الخلايا اللحمية إلى سلالة شحمية ، باستخدام علامة بروتين خاصة بالنسب ، وبروتين ربط الأحماض الدهنية أربعة. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل الخلايا اللحمية ذات الأهمية وتوسيعها أولا. ثم يتم حصاد الخلايا اللحمية وطلاءها في ألواح مزرعة قياسية في المختبر.

بعد الحضانة لبضعة أيام ، يتم التعامل مع الخلايا بوسط تمايز شحمي. يتم احتضان الخلايا لمدة 14 يوما ، مع استبدال الوسائط بانتظام. بعد التمايز ، يتم تثبيت الخلايا وتلطيخها بالأجسام المضادة ضد البروتين المرتبط بالأحماض الدهنية الأربعة.

يتم استخدام مجهر دقيق مناعي آلي عالي المحتوى لالتقاط صور للخلايا المصنفة في ألواح الميكروويل. ثم يتم تحديد التمايز كميا باستخدام برنامج تحليل الصور المتخصص. على عكس الطرق التقليدية لقياس التمايز الشحمي باستخدام أصباغ مثل Oil Red O ، يستخدم الاختبار الموصوف في هذا الفيديو جسما مضادا ضد البروتين الخاص بالسلالة ، وهو بروتين مرتبط بالأحماض الدهنية أربعة ، لتأكيد التمايز الحموي.

عند القيام بذلك ، تحدد هذه الطريقة التغيرات في التعبير الجيني التي تتوافق مع التمايز الحموي. هذا الاختبار قادر على تقديم ثروة من المعلومات ، بما في ذلك النسبة المئوية للخلايا المتمايزة ، وشدة إشارة التألق لكل خلية ، والتغيرات في مورفولوجيا الخلية. تتيح القدرة على تحليل الخصائص المتعددة تحديد التغييرات الطفيفة المحتملة في التمايز استجابة للعلاجات المختلفة.

هذا الاختبار أيضا بقدرة عالية على السحب ، مما يجعله مثاليا لتطبيقات فحص الأدوية عالية السحب. أعد تعليق الخلايا في وسط ASC كامل ، وهو وسائط قاعدية DMEM / F-12 ، مكملة بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ ، و GlutaMAX ، والمضادات الحيوية. الماصة في صفيحة استزراع 96 بئرا ، بمعدل 5000 خلية لكل بئر.

هناك حاجة إلى ثمانية آبار لكل متبرع. أربعة آبار يستلم تحكم متوسط, بينما الباقي يستلم تمايز متوسطة. كل بئر رابع من كل علاج سيخدم التحكم الأساسي في العقدة.

احتضان الخلايا عند 37 درجة ، مرطبة بحالة جوية بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة أربعة أيام. هذا للسماح للخلايا بالنمو حتى التقاء في كل بئر. في اليوم الرابع ، أخرج الأطباق من الحاضنة.

قم بإزالة نصف الوسائط من كل بئر. أضف حجما متساويا من وسط ASC الكامل ، أو وسط التمايز الشحمي ، والذي يتم استكماله بالأنسولين ، والأيزوبوتيل ميثيل زانثين ، وديكساميثازون ، والإندوميثازون. احتضان الصفيحة عند 37 درجة ، مرطبة بحالة جوية بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

الزمنية المطلوبة للتمييز الكافي هي 14 يوما. خلال هذا الوقت ، قم بتجديد الوسائط عن طريق إجراء تغيير الوسائط كل يومين إلى ثلاثة أيام. بعد التمايز ، أخرج الأطباق من الحاضنة.

جميع الوسائط بعناية من كل بئر. إصلاح الخلايا عن طريق إضافة الميثانول المثلج. احتضن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

قم بإزالة الميثانول ، ثم اغسله بمحلول ملحي مخزن في Tris. قم بالحظر عن طريق إضافة 0.25٪ من مانع الكازين. احتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

قم بإزالة الكازين ، ثم اغسله بمحلول ملحي مخزن في Tris. قم بإعداد مزيج الأجسام المضادة الأولية عن طريق تخفيف الجسم المضاد FABP4 200 مرة في المخزن المؤقت لتخفيف الأجسام المضادة. أضف الخليط إلى جميع الآبار ، باستثناء تلك المحجوزة كعنصر تحكم أساسي في العقدة.

أضف المخزن المؤقت لتخفيف الأجسام المضادة إلى هذه الآبار بدلا من ذلك. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام محلول ملحي مخزن في Tris.

قم بإزالة المحلول الملحي الطازج المخزن في Tris واحتضانه لمدة خمس دقائق على الروك. كرر هذه العملية مرتين. قم بإعداد مزيج الأجسام المضادة الثاني عن طريق تخفيف الأجسام المضادة للأرانب Alexa 488 ثانية 200 ضعف في المخزن المؤقت لتخفيف الأجسام المضادة.

أضف DAPI ، الذي يصنف نوى الخلية ، عند التخفيف النهائي من واحد إلى 2000. يضاف المزيج إلى جميع الآبار ، ويلف الطبق بورق الألمنيوم لمنع التبييض الضوئي. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

بعد الحضانة ، اغسل الخلايا باستخدام TBS ، وغسلتين إضافيتين لمدة 15 دقيقة على الروك. قم بإزالة كل المخزن المؤقت من الآبار وأضف المخزن المؤقت للتخزين ، مع 0.4 ملليغرام لكل مليلتر ثيميروسال ، لمنع نمو البكتيريا. يتم استخدام آلة فحص عالية المحتوى مزودة بمرحلة آلية وأهداف تركيز ومرشحات لتصوير هذا الاختبار الحيوي.

تحقق من وجود المرشحات الصحيحة. نظف الجزء السفلي من الطبق للحصول على أفضل جودة. قم بتحميل اللوحة في المسرح مع وضع A1 في الزاوية العلوية اليسرى.

باستخدام معالج الحصول على اللوحة، قم بتسجيل المعلومات الأساسية حول التجربة، مثل رقم اللوحة والتكبير والتاريخ والظروف التجريبية وتفاصيل الملصقات. حدد نوع لوحة الميكروويل المستخدمة. يمكن للمستخدمين تحديد الآبار وعدد المواقع التي سيتم الحصول عليها.

حدد جميع الآبار المراد تصويرها عن طريق تمييز الشبكة. انقل المسرح إلى ألمع بئر. سيضمن اختيار البئر الأكثر سطوعا الحصول على جميع الصور بقيم رمادية بكسل في نطاق خطي ، وبالتالي تتناسب طرديا مع شدة التلوين.

إذا لم يتم تنفيذ هذه الخطوة ، فقد تكون الصور الملتقطة في آبار أكثر إشراقا مشبعة. حدد مجموعات القنوات المناسبة ووقت التعرض ومعلمات إزاحة Z للتجربة. تتوافق المرشحات المستخدمة لتصوير FABP4 و DAPI مع الملصقات المحددة المستخدمة لتصور التلوين.

استخدام Alexa 488 ، الذي يثير بسرعة 480 نانومتر وينبعث بسرعة 560 نانومتر ، لتصور FABP4. واستخدمت صبغة DAPI ، التي تثير عند 360 نانومتر وتنبعث منها 460 نانومتر ، لتصور نوى الخلية. بالنسبة لللوحات التي تحمل علامة Oil Red O ، تم تصور قطرات الدهون بضوء ساطع ينتقل عن طريق الوقود.

كما تم تصور ملصق Oil Red O مع الفلورتسم ، حيث يثير عند 575 نانومتر وينبعث بسرعة 630 نانومتر. عند اكتمال جميع الإعداد ، يكون الفحص البيولوجي جاهزا للاقتناء. يتم حفظ الصورة تلقائيا على الخادم عبر الإنترنت ، لتمكين الوصول السهل عن بعد إلى الصور.

يمكن الوصول إلى المجموعة الكاملة من الصور المخزنة على الخادم عبر الإنترنت باستخدام برنامج سطح المكتب البعيد. يمكن بعد ذلك تحليل الصور باستخدام برنامج MetaXpress. يسمح تطبيق تسجيل الخلايا للمستخدمين بتحديد طول موجي للكشف عن جميع النوى في حقل ، مثل DAPI ، في هذه الحالة.

يمكن استخدام الأطوال الموجية اللاحقة للكشف عن علامة موجبة إما في النواة أو السيتوبلازم أو كلا موقعي الخلية. البروتين المرتبط بالأحماض الدهنية أربعة ، أو FABP4 ، هو علامة على النسب الشحمية. يتم ترجمة التعبير عن FABP4 في النواة وسيتوبلازم الخلايا الشحمية المتمايزة.

في هذا الفحص البيولوجي ، نقوم بتحليل تعبير FABP4 ، باستخدام وحدة تسجيل الخلايا. أولا ، اكتشف نوى الخلية باستخدام قناة DAPI ، مع معلمات يحددها المستخدم للحجم وشدة الإشارة فوق الخلفية. اكتشف إشارة FABP4 باستخدام قناة القدم C ، والمعلمات المحددة من قبل المستخدم للحجم وشدة الإشارة فوق الخلفية.

في هذا الاختبار البيولوجي ، تم تحليل قطرات الدهون ذات العلامات الزيتية الحمراء ، والتي تنهار في نطاق 560 نانومتر ، باستخدام وحدة علب MetaXpress ، Transflour. تكتشف خوارزمية التحليل هذه الخلايا الكلية باستخدام النوى المسماة DAPI ، والتي تلبي حجم الخلية ومعايير شدة التلوين المحددة من قبل المستخدم. يحدد المستخدم أيضا حجم وشدة الحفر ، والتي تكتشف في هذه الحالة قطرات الدهون بالقرب من النوى الخلوية.

يتم تسجيل المعلومات المتعلقة بحجم قطرات الدهون ، وشدة التلوين ، والعدد لكل خلية ، بواسطة مقايسة Transflour. من المهم ملاحظة أن ملصق Oil Red O قد تسرب أو يذوب من بعض الخلايا ، مما قد يحد من المقدار الحقيقي للتمايز الذي يحدث ويربكه. يتم عرض الصور التمثيلية للمرور المبكر والمتأخر والتحكم والخلايا المتمايزة ، المسمى ب DAPI ، وصمة عار نووية ، و FABP4 جنبا إلى جنب مع صور الدمج والتجزئة.

تعرض صور التجزئة خلايا متمايزة مع تراكب أخضر وخلايا غير متمايزة مع تراكب أحمر. تم استخدام النسبة المئوية للخلايا التي تعبر عن FABP4 كمقياس لإمكانات التمايز الحموي. لوحظت زيادة كبيرة في الخلايا التي تعبر عن FABP4 مع التمايز الشاحم في خلايا المرور المبكرة والمتأخرة.

أظهرت خلايا المرور المبكرة زيادة أكبر بكثير في التمايز من خلايا المرور المتأخرة. يتم عرض الصور التمثيلية ل DAPI و Oil Red O جنبا إلى جنب مع صور الدمج والتجزئة. تصور صور التجزئة جميع النوى مع تراكب أخضر ، وقطرات دهنية ملطخة باللون الأحمر الزيتي مع تراكب أحمر.

تم استخدام منطقة تلطيخ الزيت الأحمر O لكل خلية كمقياس لإمكانات التمايز الشحمية. لوحظت زيادة كبيرة في منطقة تلطيخ Oil Red O مع التمايز الحموي. أظهرت خلايا المرور المبكرة مساحة أكبر من صبغة Oil Red O لكل خلية ، مقارنة بخلايا المرور المتأخرة.

تم إجراء اللطخة الغربية لتحليل مستوى تعبير بروتين FABP4 من ASCs المتباينة في المرور المبكر والمتأخر. أظهر التحليل شبه الكمي للكثافة البصرية لنطاقات FABP4 كنسبة من التحكم في تحميل البروتين الكلي أن الملصقات المناعية FABP4 قد زادت بشكل كبير في المرور المبكر ، وبدرجة أقل ، الخلايا المتمايزة في المرور المتأخر. من خلال مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون قد اكتسبت فهما لكيفية تمييز الخلايا الجذعية إلى سلالة شحمية ، وكيفية إجراء تلطيخ الفلور المناعي باستخدام علامة خاصة بالجين الشحمي ، وبروتين ربط الأحماض الدهنية أربعة ، وأخيرا ، كيفية تصوير وتحليل جميع الميزات المورفولوجية ذات الصلة من الخلايا الإيجابية للمناعة لبروتين ربط الأحماض الدهنية أربعة.

أتمنى أن تجد هذا الفيديو مفيدا لبحثك.