العزل الفعال للخلايا الجذعية المشتقة من الدهون والخلايا الدهنية من نسيج الدهون الخنازيري

الغرض من هذا البحث هو عزل الخلايا من الأنسجة الدهنية بكفاءة وسرعة. الهضم التقليدي يتطلب وقتا طويلا وقد يفرط في الهضم. يوفر مقياس الموجات الإنزيمي والميكانيكي لدينا تشتتا لطيفا ويقلل من وقت العزل.

للبدء، ضع قطعة من نسيج دهني تحت الجلد لخنزير تم إعداده في طبق زراعة. قم بتحليل الشريحة على المستوى الطبيعي بين النسيج الدهني والأدمة للحصول على صفيحة ULB كاملة بسماكة من اثنين إلى ثلاثة مليمترات. اشطف ال ULB مرة واحدة في محلول ملحي معقم بارد جدا.

بعد تمزيق طبق الزراعة المعقمة، قم بوزن الأنسجة في الطبق المعقم على ميزان معقم مسبقا. لكل 1.8 جرام من الأنسجة، أضف 10 ملليلتر من محلول D-Hank البارد جدا، وحافظ على النسيج مغمورا بالكامل. استخدم المقص الجراحي المعقم لتحديد وإزالة جميع الأوعية الدموية المرئية من الأنسجة.

قم بإزالة أي نسيج ضام ومكونات ليفية. تخلص من المواد المستخرجة في حاويات مخصصة للخطر البيولوجي. اشطف الأنسجة داخل مخزن دي-هانك لإزالة الدم المتبقي والحطام.

وزن النسيج في طبق الزراعة المعقمة على ميزان معقم مسبقا بعد تمزيق الطبق. انقل 1.8 جرام من شظايا أنسجة الشطف إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم بسعة 1.5 ملليلتر. أضف 800 ميكرولتر من محلول تفكك الأنسجة من النوع A إلى الأنبوب.

استخدم مقص العيون المعقم لتقطيع الأنسجة في الأنبوب إلى قطع بحجم يقارب مليمتر مكعب إلى ميليمتر مكعب. انقل نسيج اللحم المفروم مع المخزن المحيط إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. أضف 200 ميكرولتر من عامل تفكك الأنسجة من النوع A إلى الأنبوب.

قم بتدوير الأنبوب بلطف وهزه يدويا ثلاث مرات لخلط المحتويات. تأكد من أن شظايا الدهون مغمورة بالكامل في محلول التفكك. تحقق مما إذا كان غطاء الأنبوب مغلقا بإحكام.

ضع الأنبوب في حمام معدني بدرجة حرارة 37 درجة مئوية وحضن الأنبوب لمدة خمس إلى عشر دقائق. انقل النسيج الدهني المهضم جزئيا في العزل إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم بسعة 1.5 مليليتر مخصص لنظام التفكك الميكانيكي. شغل البرنامج المحدد مسبقا للأنسجة الدهنية لإجراء التفكك الميكانيكي باستخدام موجة جيبية بسرعة 200 هرتز.

اجمع تعليق الخلية ومرره عبر مصفاة خلية بسعة 200 ميكرومتر إلى أنبوب طرد مركزي جديد بسعة 50 ملليتر. أضف خمسة ملليلتر من محلول D-Hank قبل التبريد عند أربع درجات مئوية إلى المصفاة. اشطف المصفاة مرتين بمحلول D-Hank.

قم بعمل الطرد المركزي لتعليق الخلية المفلتر عند 500 جيلون لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. استخدم ماصة معقمة لاستنشاق وتخلص طبقة الدهون الفوقية مع ترك ملليلتر واحد من المخزن لحماية طبقة الخلايا الدهنية. اجمع الطبقة الثانية التي تحتوي على الخلايا الدهنية دون الإزعاج بالطبقتين الثالثة والرابعة.

استنشق الطبقة الثالثة وتخلص منها. أضف ملليلتر واحد من حاجز D.Hank إلى الحبيبة السفلية التي تحتوي على الجزء الوعائي السمكي أو SVF. أعد تعليق الحبيبة الخلوية بلطف في المخزن المؤقت لتحقيق تركيز خلوي يتراوح بين اثنين إلى خمسة أضعاف 10 بقوة ست خلايا لكل ملليلتر.

جهز تعليق خلية SVF في أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مليليتر. حافظ على التعليق على التجميد حتى الاستخدام. أضف 10 ميكرولتر من نظام تعليق خلية SVF و10 ميكرولترات من محلول 0.4٪ تريبان بلو في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم بسعة 0.5 ميليتر.

استخدم الماصة بلطف صعودا وهبوطا ثلاث مرات. انقل 10 ميكرولتر من خليط الخلايا الملونة إلى شريحة عد مناسبة لعداد الخلايا الآلي. تحقق من أن العينة تملأ الغرفة بالكامل دون أن تفيض من الغرفة.

أدخل شريحة العد في عداد الخلايا الآلي. اختر نوع اختبار Trypan Blue واضبط نطاق تركيز الخلية إذا لزم الأمر. اضغط على زر العد لبدء العد الآلي للخلايا.

راقب صور غرفة العد وراقب التمييز التلقائي بين الخلايا الحية والميتة. سجل نسبة صلاحية الخلايا وإجمالي عدد الخلايا الصالحة للحياة المعروضة على شاشة الأداة. قم بإجراء ثلاث قياسات مستقلة لكل عينة.

احسب متوسط قابلية البقاء وإنتاج الخلايا لكل جرام من نسيج دهني. حضر محلول تلوين يحتوي على خمسة ميكروغرامات لكل ملليلتر مع هوكسد وقرص ميكرومولار واحد من بوديبي في D.Hank's. حضن الخلايا الدهنية المعزولة في محلول التلوين لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.

استخدم نظام زجاجي يغطى شرائح صديق لخلايا الدهون من صنع نفسي لتحضيرات الشرائح المناسبة للمجهر الفلوري. مكن نظام التثبيت الصديق لخلايا الدم المنزلي من توزيع موحد للخلايا دهنية سليمة للتصوير الواضح. على عكس الطرق التقليدية التي أنتجت ترتيبات متعددة الطبقات ومزدحمة، أظهرت الخلايا الدهنية المستخرجة بنية سليمة وشكل طبيعي.

كان معدل بقاء الخلايا الدهنية التي تم الحصول عليها بواسطة طريقة التفكك الميكانيكي أعلى بشكل ملحوظ مقارنة بالطريقة التقليدية للتحلل الإنزيمي. أظهرت الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون المنقاة والمزرعة شكلا موحدا يشبه الأرومات الليفية مع خلايا مغزل ممدودة مرتبة بشكل منظم. معظم الخلايا بقيت غير مصبوغة، مما يدل على البقاء، بينما تم تلوينها باللون الأزرق نسبة صغيرة فقط، مما يمثل الخلايا الميتة.

يتيح هذا البروتوكول للباحثين مقارنة خصائص الخلايا المعزولة عبر مستودع الدهون. يمكن استخدام SVFs المعزولة من البروتوكول لبناء الخلايا العضوية وتنقية الخلايا الجذعية الدهنية. يمكن للدراسة المستقبلية تحسين طريقة العزل بشكل أكبر، مع الأخذ في الاعتبار اختلافات الأنسجة الدهنية في المصفوفة خارج الخلية عبر المستودع.