Name: التصور للنشاط الكهربائي الخلوية في الزرد الأجنة في وقت مبكر، والأورام (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: اكتشف طريقة تصور التغيرات الكهربائية الخلوية في أجنة الزرد باستخدام خطوط Danio rerio المعدلة وراثياً. تتيح هذه التقنية تتبع الإشارات الكهربائية في الوقت الفعلي لدراسة التطور الجنيني وتكوين الأورام.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد أعمال البحث التي ذكرت في هذا المنشور بالمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة "معاهد الصحة الوطنية في" إطار جائزة رقم R35GM124913 وبرنامج الحوافز PI4D جامعة بوردو، والتنافسية الداخلية PVM برنامج صناديق الأبحاث الأساسية. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية لعملاء التمويل. ونحن نشكر كويشي كاواكامي لبناء Tol2، مايكل لين لبناء ASAP1، وتشييد زون ليونارد للمروج يو بي أي عن طريق أدجيني.

<ol><li>Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+bioelectricity%3A+how+endogenous+voltage+potentials+control+cell+behavior+and+instruct+pattern+regulation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular bioelectricity: how endogenous voltage potentials control cell behavior and instruct pattern regulation in vivo.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3835-3850 (2014).</li>
<li>Storace, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+Better+Genetically+Encoded+Sensors+of+Membrane+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential.</a> Trends in Neuroscience. 39 (5), 277-289 (2016).</li>
<li>Inagaki, S., Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+progress+in+genetically+encoded+voltage+indicators+for+neural+activity+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Current progress in genetically encoded voltage indicators for neural activity recording.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 33, 95-100 (2016).</li>
<li>St-Pierre, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+optical+reporting+of+neuronal+electrical+activity+with+an+ultrafast+fluorescent+voltage+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor.</a> Nature Neuroscience. 17 (6), 884-889 (2014).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li>
<li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooked%21+Modeling+human+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. , (2013).</li>
<li>Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+functional+transposase+of+the+Tol2+element%2C+an+Ac-like+element+from+the+Japanese+medaka+fish%2C+and+its+transposition+in+the+zebrafish+germ+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (21), 11403-11408 (2000).</li>
<li>Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transposition+of+the+Tol2+transposable+element+from+a+single-copy+donor+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 105 (50), 19827-19832 (2008).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
<li>Mosimann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitous+transgene+expression+and+Cre-based+recombination+driven+by+the+ubiquitin+promoter+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ubiquitous transgene expression and Cre-based recombination driven by the ubiquitin promoter in zebrafish.</a> Development. 138 (1), 169-177 (2011).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).</li>
<li>Ordovas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+small-size+DNA+fragments+using+agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Separation of small-size DNA fragments using agarose gel electrophoresis.</a> Methods in Molecular Biology. 110, 35-42 (1998).</li>
<li>Downey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+DNA+from+agarose+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Extraction of DNA from agarose gels.</a> Methods Mol Biol. 235, 137-139 (2003).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> Journal of Visualized Experiments. 45 (45), (2010).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).</li>
<li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247(2007).</li>
<li>Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+PCR-ready+genomic+DNA+from+zebrafish+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues.</a> Biotechniques. 43 (5), 610, 612, 614 (2007).</li>
<li>Kawakami, K., Koga, A., Hori, H., Shima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excision+of+the+tol2+transposable+element+of+the+medaka+fish%2C+Oryzias+latipes%2C+in+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Excision of the tol2 transposable element of the medaka fish, Oryzias latipes, in zebrafish, Danio rerio.</a> Gene. 225 (1-2), 17-22 (1998).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th edn, Univ. of Oregon Press. (2000).</li>
<li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+ribosomal+protein+genes+are+cancer+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Many ribosomal protein genes are cancer genes in zebrafish.</a> PLoS Biology. 2 (5), E139(2004).</li>
<li>Lai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+ribosomal+protein+mutations+are+associated+with+growth+impairment+and+tumor+predisposition+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Many ribosomal protein mutations are associated with growth impairment and tumor predisposition in zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 238 (1), 76-85 (2009).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+oncogenomic+analysis+of+copy+number+alterations+in+human+and+zebrafish+tumors+enables+cancer+driver+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative oncogenomic analysis of copy number alterations in human and zebrafish tumors enables cancer driver discovery.</a> PLoS Genetics. 9 (8), e1003734(2013).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+aneuploid+zebrafish+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+have+genetic+alterations+similar+to+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Highly aneuploid zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors have genetic alterations similar to human cancers.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 107 (39), 16940-16945 (2010).</li>
<li>Urrego, D., Tomczak, A. P., Zahed, F., Stuhmer, W., Pardo, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+channels+in+cell+cycle+and+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London+Series+B%22%5BJournal%5D)">Potassium channels in cell cycle and cell proliferation.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B. 369 (1638), 20130094(2014).</li>
<li>Yang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+Imaging+of+Voltage+and+Calcium+Signals+Reveals+Neural+Processing+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subcellular Imaging of Voltage and Calcium Signals Reveals Neural Processing In Vivo.</a> Cell. 166 (1), 245-257 (2016).</li>
<li>Chamberland, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+two-photon+imaging+of+subcellular+voltage+dynamics+in+neuronal+tissue+with+genetically+encoded+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Hochbaum, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-optical+electrophysiology+in+mammalian+neurons+using+engineered+microbial+rhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins.</a> Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).</li>
<li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+cell-cycle+progression+in+the+developing+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 106 (49), 20812-20817 (2009).</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

على الرغم من أن تم اكتشاف الخلايا والأنسجة ومستوى الأنشطة الكهربائية أثناء التطور الجنيني والأمراض البشرية منذ زمن طويل، في فيفو الكهربائية التغيرات الدينامية ودورها البيولوجي لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. أحد التحديات الرئيسية هو تصور وتحديد التغييرات الكهربائية. التكنولوجيا المشبك التصحيح كسر عبر لتتبع الخلايا المفردة، ولكن يقتصر تطبيقه على أجنة الفقاريات لأنها تتكون من العديد من الخلايا. الأصباغ الكيميائية الجهد الحالي أيضا ليست مثالية بسبب الحساسيات، وخصائصها، والسمية. الجهود التي بذلت مؤخرا في اختراع جيفي...

ويشير تستخرجها للإشارات الكهربائية الذاتية بوساطة قنوات أيون والمضخات الموجودة على غشاء الخلية1. تبادل أيونى عبر الغشاء الخلوي، وإلى جانب التغييرات الحالية والمحتملة الكهربائية، ضرورية لإشارات عمليات خلايا العصبية والعضلات منفعل. وباﻹضافة إلى ذلك، تستخرجها والتدرجات وأيون لها مجموعة متنوعة من الوظائف البيولوجية الهامة الأخرى بما في ذلك تخزين الطاقة والنقل المستقلب والحيوي،. إشارات bioelectrical اكتشفت أيضا كمنظم لتشكيل نمط الجنينية، مثل هيئة المحاور، ودورة الخلية، والخلية التمايز1. وبالتالي، من الأهمية بمكان لفهم العديد من الأمراض الخلقية البشرية التي تنجم عن سوء تنظيم هذا النوع من الإشارات. على الرغم من أن المشبك التصحيح قد استخدمت على نطاق واسع لتسجيل الخلايا المفردة، أنها لا تزال بعيدة عن المثالية للرصد المتزامن لخلايا متعددة أثناء التطور الجنيني في فيفو. وعلاوة على ذلك، الجهد جزيئات صغيرة حساسة أيضا ليست مثالية للتطبيقات في فيفو نظراً لخصائصها، والحساسيات، والسمية.
إنشاء مجموعة متنوعة من وراثيا ترميز الجهد الفلورسنت المؤشرات (جيفيس) يوفر إليه جديدة للتغلب على هذه المشكلة، ويسمح للتطبيقات سهلة لدراسة التطور الجنيني، على الرغم من أنها كانت مخصصة أصلاً لرصد العصبية الخلايا2،3. واحد جيفيس المتاحة حاليا هو تسارع جهاز استشعار لإمكانات العمل 1 (ASAP1)4. وهو يتألف من حلقة خارج الخلية في مجال الاستشعار عن بعد الجهد الجهد الفوسفاتيز الحساسة وبروتين فلوري أخضر دائري مبدل. ولذلك، يسمح ASAP1 التصور للتغيرات المحتملة الكهربائية الخلوية (الاستقطاب: أخضر ساطع؛ depolarization: أخضر داكن). ASAP1 2 مللي ثانية وإيقاف حركية، ويمكن تعقب التغيير المحتمل سوبثريشولد4. وبالتالي، تتيح هذه الأداة الوراثية لمستوى جديد من الكفاءة في رصد الاحتمالات في الوقت الحقيقي في الخلايا الحية. زيادة فهم أدوار تستخرجها في التطور الجنيني وكثير من الأمراض البشرية، مثل السرطان، سوف ضوءا جديداً على الآليات الكامنة، التي حاسمة بالنسبة للوقاية والعلاج من الأمراض.
ثبت الزرد نموذج حيوان قوية لدراسة علم الأحياء التنموي والأمراض البشرية بما في ذلك السرطان5،6. تتبادل الجينات أورثولوجوس 70% مع البشر، ولديهم بيولوجيا الفقاريات مماثلة7. الزرد توفير الرعاية سهلة نسبيا، وحجم مخلب كبير من البيض وتتبعها الوراثة، ترانسجينيسيس سهلة وشفافة من التنمية الجنينية الخارجية، مما يجعلها نظام متفوقة في فيفو التصوير5،6. مصدر كبير للأسماك متحولة خطوط موجودة بالفعل وجينوم الكامل متتابع، ستوفر الزرد نطاق محدود نسبيا من الاكتشافات العلمية.
للتحقيق في فيفو في الوقت الحقيقي النشاط الكهربائي للخلايا، علينا الاستفادة من النظام النموذجي الزرد و ASAP1. في هذه الورقة، تصف كيفية إدماج biosensor الجهد نيون ASAP1 في الجينوم الزرد استخدام Tol2 ينقول ترانسجينيسيس، وتصور النشاط الكهربائي الخلوية أثناء التطور الجنيني، حركة الأسماك اليرقات، وفي ورم لايف .

<table><tbody><tr><td>أنابيب زراعة الخلايا سعة 14 مل</td><td>VWR</td><td>60818-725</td><td>ثقافة الإشريكية القولونية</td></tr><tr><td>خزان الرحلان الكهربائي الاغاروز</td><td>البومة</td> العلمية <td>الحرارية B2</td><td>الرحلان الكهربائي للحمض النووي</td></tr><tr><td>Agarose RA</td><td>Amresco</td><td>N605-500G</td><td>لصنع المواد الهلامية للحقن</td></tr><tr><td>Attb1-ASAP1-F التمهيدي</td><td>IDT DNA</td><td>GGGGACAAGTTTACAAAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA</td><td>تضخيم منطقة الترميز ASAP1 للاستنساخ الفرعي</td></tr><tr><td>Attb2-ASAP1-R التمهيدي</td><td>IDT DNA</td><td>GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC AAGTTGTTTCTTCTGAAGCCA</td><td>ASAP1 تضخيم منطقة الترميز للاستنساخ</td></tr><tr><td>الفرعي نطاق تشريح المجال</td><td>الساطع نيكون</td><td>SMZ 745</td><td>Dechorionation ، الحقن المجهري ، تركيب</td></tr><tr><td>الكاميرا الملونة</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam MRc</td><td>جنين الأسماك تسجيل الصورة</td></tr><tr><td>الشريحة المقعرة</td><td>VWR</td><td>48336-001</td><td>لحمل أجنة الأسماك أثناء عملية التصوير</td></tr><tr><td>ماصة نقل يمكن التخلص منها 3.4 مل</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td>أجنة الأسماك ونقل</td></tr><tr><td>المياه إنزيم نوكلياز داخلي ، وليس أنا</td><td>NEB</td><td>R0189L</td><td>لخطية الحمض النووي البلازميد</td></tr><tr><td>نطاق مركب</td><td>Zeiss</td><td>Axio Imager.A2</td><td>Fish تصوير الأجنة</td></tr><tr><td>نطاق تشريح ستيريو epifuorescent</td><td>Zeiss</td><td>Stereo Discovery.V12</td><td>تصوير أجنة الأسماك</td></tr><tr><td>مصدر ضوء الفلورسنت</td><td>ديناميكيات التجويف</td><td>X-cite seris 120</td><td>مصدر الضوء للمجاهر الفلورية</td></tr><tr><td>ملقط # 5</td><td>WPI</td><td>500342</td><td>Dechorionation وكسر الإبرة</td></tr><tr><td>Gateway BP Clonase II مزيج الإنزيم</td><td>Thermo Scientific</td><td>11789020</td><td>بوابة BP إعادة التركيب استنساخ</td></tr><tr><td>بوابة LR Clonase II Plus إنزيم</td><td>Thermo Scientific</td><td>12538120</td><td>Gateway LR إعادة التركيب</td></tr><tr><td>هلام استعادة الحمض النووي</td><td>كيت Zymo Research</td><td>D4002</td><td>تنقية هلام الحمض النووي</td></tr> طرف <tr><td>التحميل</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>لتحميل محلول الحقن في الإبر الكابيلاري</td></tr><tr><td>ميثيل السليلوز (1600cPs)</td><td>Alfa Aesar</td><td>43146</td><td>تصاعد جنين السمك</td></tr><tr><td>الميثيلين الأزرق</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>يقمع تفشي الفطريات في أطباق بتري</td></tr><tr><td>قالب الحقن الدقيق</td><td>أدوات العلوم التكيفية</td><td>TU-1</td><td>لتحضير صينية قالب agaorse لحمل أجنة الأسماك أثناء الحقن</td></tr><tr><td>الحاقن الدقيق</td><td>WPI</td><td>Picopump الهوائي PV820</td><td>حاقن الحقن</td></tr><tr><td>الدقيق مناور</td><td>Micro WPI</td><td>حاقن دقيق MM3301R</td><td>عملية الحقن الدقيق</td></tr><tr><td>مجتذب الماصات</td><td>الدقيقة أداة Sutter</td><td>P-1000</td><td>لتحضير إبرة شعرية</td></tr><tr><td>زيت معدني</td><td>Amresco</td><td>J217-500ml</td><td>لمعايرة حجم الحقن</td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 طقم النسخ</td><td>الحراري العلمي</td><td>AM1340</td><td>mRNA في النسخ المختبري</td></tr><tr><td>كاميرا أحادية اللون</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam MRm</td><td>تسجيل صورة جنين الأسماك</td></tr><tr><td>مجموعة البلازميد Miniprep</td><td>Kit Zymo Research</td><td>D4020</td><td>تحضير كمية صغيرة من أطباق بلازميد الحمض النووي</td></tr><tr><td>البلاستيكية</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>لحمل أجنة الأسماك أو الأسماك أثناء عملية</td></tr><tr><td>التصوير الحمض النووي الريبي نظيف & المكثف -5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td>تنظيف mRNA بعد النسخ في المختبر</td></tr><tr><td>مقياس الطيف</td> الضوئي <td>الحراري العلمي</td><td>NanoDrop 2000</td><td>لقياس تركيزات الحمض النووي والحمض النووي الريبي</td></tr><tr><td>المرحلة ميكرومتر</td><td>Am نطاق</td><td>MR100</td><td>معايرة حجم الحقن</td></tr><tr><td>الدقيق Thermocycler</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td>تضخيم الحمض النووي لاستنساخ الجينات</td></tr><tr><td>جدار رقيق الشعيرات الدموية الزجاجية</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td>الزجاج الخام لصنع إبرة كابلاري</td></tr><tr><td>Tol2-exL1 التمهيدي</td><td>IDT DNA</td><td>GCACAACACCAGAAATGCCCTC</td><td>مقايسة المكوس Tol2-exR</td></tr><tr><td>التمهيدي</td><td>IDT DNA</td><td>ACCCTCACTAAAGGGAACAAAG</td><td>TOL2 مقايسة المكوس</td></tr><tr><td>TOP10 المختصة كيميائيا بكتريا قولونية</td><td>C404006 علمية</td><td></td><td>حرارية تستخدم للتحويل أثناء استنساخ</td></tr> <tr><td>الجيناتالتريكايين ميسيلات</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>A5040</td><td>لتخدير الأسماك أو أجنة الأسماك الأشعة</td></tr><tr><td>فوق البنفسجية العابرة للإضاءة 302 نانومتر</td><td>UVP</td><td>M-20V</td><td>تصور الحمض النووي</td></tr><tr><td>حمام مائي</td><td>حراري علمي</td><td>2853</td><td>لعملية تحويل استنساخ الجينات</td></tr></tbody></table>

التصور للنشاط الكهربائي الخلوية في الزرد الأجنة في وقت مبكر، والأورام

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

تنوعها والإشارات الكهربائية الذاتية بوساطة قنوات أيون والمضخات الموجودة على غشاء الخلية، تلعب أدواراً هامة في إشارات العمليات منفعل من الخلايا العصبية والعضلات والعديد من العمليات البيولوجية الأخرى، مثل الجنينية الزخرفة التنموية. ومع ذلك، هناك حاجة لرصد النشاط الكهربائي في فيفو في embryogenesis الفقاريات. التقدم المحرز مؤشرات الجهد الفلورسنت المشفرة جينياً (جيفيس) مكنت لتوفير حل لمواجهة هذا التحدي. هنا، نحن تصف كيفية إنشاء الزرد مؤشر جهد المحورة وراثيا استخدام مؤشر الجهد المعمول، ASAP1 (تسارع جهاز استشعار لإمكانات العمل 1)، على سبيل مثال. يو بي أي، اختيرت كيت Tol2 ومروج الزرد في كل مكان، في هذه الدراسة. ونحن أيضا شرح عمليات استنساخ بوابة الموقع، Tol2 الزرد المستندة إلى ينقول ترانسجينيسيس، وعملية التصوير للأورام الأجنة والأسماك الأسماك في مرحلة مبكرة باستخدام المجاهر العادية ابيفلوريسسينت. استخدام هذا الخط الأسماك، وجدنا أن هناك تغيرات الجهد الكهربائي الخلوية أثناء embryogenesis الزرد، وحركة الأسماك اليرقات. وعلاوة على ذلك، فقد لوحظ أن ورم الخلايا كانت عموما الاستقطاب في أورام غمد الأعصاب الطرفية الخبيثة الزرد قليلة، مقارنة بالانسجة الطبيعية المحيطة بها.

في حقن ناجحة، أكثر من أجنة الأسماك 50% حقن سيتم عرض بعض درجة الفلورية الخضراء في الخلايا الجسمية، ومعظمها سيكون إيجابيا بمقايسة المكوس ينقول Tol2 (الشكل 2). بعد خارج عبر الأجيال 2-4 مع الأسماك wildtype (حتى الأسماك الفلورية تصل إلى 50 في المائة ونسبة مندلية المتوقعة)، والأسماك المحورة وراثيا استخدمت لتجربة التصوير لتعقب إمكانات غشاء الخلية أثناء التطور الجنيني. أولاً، تم فحص التغيرات المحتملة غشاء طوال دورة الخلية أثناء مراحل النمو الجنيني المبكر الزرد. ولوحظ...

هنا، نحن إظهار عملية إنشاء خط جهد كهربائي خلوية الزرد مراسل لتصور التنمية الجنينية، والحركة، والأسماك ورم الخلايا في الجسم الحي.

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء خط أسماك الزرد المعدلة وراثيا يسمح بمراقبة التغيرات الكهربائية الخلوية أثناء التطور الجنيني وحركة اليرقات وتكوين الورم. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات علم الأحياء التنموي وعلم وظائف الأعضاء وبيولوجيا الخلايا السرطانية مثل ما هي الأدوار الأساسية للإشارات الكهربائية الخلوية أثناء التطور الجنيني وفي الخلايا السرطانية؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح لنا بتتبع الإشارات الكهربائية الخلوية في الجسم الحي وفي الوقت الفعلي.بعد تحضير Tol2 transposase mRNA ومحلول الحقن وفقا لبروتوكول النص ، بعد ظهر اليوم قبل الحقن ، قم بإعداد أربعة إلى ستة خزانات تكاثر مع اثنين على الأقل من الذكور واثنتين من الإناث. لتقليل كمية نفايات الأسماك وتحفيز استجابة التكاثر ، تجنب إطعام الأسماك في فترة ما بعد الظهر. في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة محلول الحقن المحضر من الفريزر سالب 80 درجة مئوية وضعه على الثلج.اسحب الفواصل في أحواض تربية الأسماك واترك الأسماك تتزاوج. بشكل عام ، تضع الأسماك البيض في غضون 20 إلى 30 دقيقة. أثناء الانتظار ، باستخدام مجتذب ماصة دقيقة مع المعلمات التالية ، اسحب الإبر من الزجاج الشعري.استخدم منديل مختبري لكسر نهاية الإبرة وإنشاء حافة مشطوفة. يفضل قطر أصغر لتقليل وفيات الأجنة. بمجرد أن تضع الأسماك البيض ، اجمعها في طبق بتري قطره 10 سم.مباشرة تحت مجهر التشريح ، قم بإزالة جميع الأجنة غير الطبيعية ونفايات الأسماك. ثم ماصة الأجنة المخصبة في قالب حقن الاغاروز المحضر بنسبة 3٪. قم بإزالة الماء الزائد للمساعدة في الحفاظ على الأجنة في مكانها.بمجرد أن تمتلئ جميع الصفوف بأجنة قابلة للحياة ، قم بترتيبها بحيث يتم توجيه جميع الخلايا المفردة بزاوية 45 درجة أفقيا فيما يتعلق بالإبرة. هذا سيجعل الحقن أسهل بكثير في وقت لاحق. بعد ذلك ، أثناء ارتداء القفازات ، استخدم طرف ماصة تحميل سعة 20 ميكرولتر لإزالة خمسة ميكرولترات من الهيكل المحضر من الأنبوب الموجود على الجليد.أدخل طرف الماصة بحذر في الطرف الخلفي للأنبوب الشعري المكسور حيث يبدأ في الاستدقاق للحصول على الكاشف بالقرب من الحافة قدر الإمكان وطرده في الشعيرات الدموية. إذا كانت لا تزال هناك فقاعات هواء ، فقم بهز الإبرة مع التأكد من عدم كسر الحافة. أدخل الإبرة مباشرة في حامل إبرة الحقن الدقيق وشدها بعناية حتى تبقى الإبرة في مكانها.ثم اضبط الزاوية على حوالي 45 درجة. بمجرد تحضير الإبرة وتثبيتها ، قم بتشغيل المجهر وخزان ضغط الغاز. اضبط حجم الحقن باستخدام ما يقرب من 0.5 رطل لكل بوصة مربعة للتثبيت و 30 رطل لكل بوصة مربعة للطرد.تأكد من خروج المحلول من الإبرة عند الضغط على الدواسة. باستخدام ميكرومتر المرحلة مع قطرة من الزيت المعدني ، اضبط حجم وتدفق المحلول إلى قطر 10 ميكرومتر تقريبا. تأكد من أن الضغط الخلفي يسمح بكمية صغيرة من المحلول بالتنقيط من الإبرة.إذا لم يكن هناك ضغط خلفي كاف ، فإن العمل الشعري سيؤدي إلى دخول السائل إلى الإبرة وتدمير الرنا المرسال. بمجرد معايرة الإبرة ، أدخل الإبرة في الخلية المفردة للأجنة المخصبة باستخدام حافة شق الجل لتوفير دعامة تحافظ على الجنين في مكانه وتسمح للإبرة بالضغط دون تحريك الجنين. بمجرد أن يصبح طرف الإبرة في الخلية المفردة ، اضغط على الدواسة لتحرير الكمية المطلوبة من المحلول.من المهم حقن المحلول في الخلية ، وليس صفار البيض ، لتوليد سمك الزرد المعدل وراثيا. كرر هذه العملية لجميع الأجنة. عند الانتهاء ، استخدم ماصة نقل 3.4 مل ومياه نظام الأسماك لنقل الأجنة المحقونة إلى طبق مصنف عن طريق شطفها من شق الاغاروز.قم بتخزين الأجنة في حاضنة 28.5 درجة مئوية للسماح لها بالنمو. تحقق مرة أخرى على مدار اليوم لإزالة أجنة الأسماك الميتة واستبدال الماء ب 0.1٪ ميثيلين بلو في ماء السمك. بعد حوالي ست إلى ثماني ساعات من الحقن ، استخدم 10 أجنة أسماك محقونة وطريقة hotshot لتحضير الحمض النووي الجيني.في صباح اليوم التالي ، استخدم مجهر تشريح بمصدر ضوء فلوري لفرز الأجنة التي تظهر GFP في الأنسجة غير الصفار. يجب أن تحتوي هذه الأجنة على البنية المحقونة. قم بإجراء اختبار المكوس Tol2 للتحقق من نشاط الينقولات كما هو موضح سابقا.إذا أمكن اكتشاف البلازما المستخلصة ، احتفظ بأجنة الأسماك المحقونة وقم بتربيتها. خلاف ذلك ، كرر عملية توليف Tol2 mRNA وعملية الحقن الدقيق حتى تحقق نتائج إيجابية من اختبار الضريبة Tol2. لتصوير أجنة الزرد ، تتقاطع بين الأسماك المؤسسية متعددة الجيل F2 مع الأسماك البرية في أزواج فردية.اجمع أجنة الأسماك في مراحل النمو المختلفة المرغوبة وفقا لدليل التدريج لسمك الزرد. بالنسبة لأجنة الأسماك في المرحلة المبكرة في مياه نظام الأسماك ، تحت نطاق التشريح ، استخدم زوجا من الملقط لتقشير المشيمات وإزالتها بعناية. استخدم ماصة نقل التخلص لنقل عدد قليل من الأجنة إلى شريحة زجاجية مقعرة تحتوي على 3٪ ميثيل السليلوز.ثم باستخدام إبرة أسفل نطاق التشريح ، اضبط الأجنة على المواضع المطلوبة لعرض نشاط GFP الخلوي. بالنسبة للأجنة في مرحلة أقل من 12 جسيمة ، استخدم مجهر مركب epifluorescence مع كاميرا متوافقة وبرنامج للتصوير. بالنسبة للأجنة التي تجاوزت مرحلة 12 جسيمة ، استخدم مجهر تشريح الفلورة.لتصوير جهد الخلايا السرطانية ، حدد أولا الأسماك المصابة بأورام غمد الأعصاب المحيطية الخبيثة أو MPNST. ضع السمكة في طبق بتري قطره 10 سم وقم بإجراء تصوير كامل للتركيب. أخيرا بعد التصوير ، قم بتشريح الورم قبل عرض النشاط الكهربائي للخلية السرطانية.في الحقن الناجح ، سيظهر أكثر من 50٪ من الأجنة المحقونة درجة معينة من GFP في الخلايا الجسدية وسيظهر معظمها نتيجة إيجابية من مقايسة الينقولات Tol2. هنا تم فحص التغيرات المحتملة للغشاء طوال دورة الخلية أثناء التطور الجنيني المبكر لأسماك الزرد. كما رأينا في هذا الفيديو بفاصل زمني ، فرط استقطاب الخلايا قبل تكوين ثلم الانقسام.علاوة على ذلك ، أظهرت الأنسجة المختلفة مجموعة متنوعة من إمكانات الغشاء في أجنة الأسماك التي يبلغ عمرها يوما إلى ثلاثة أيام. على سبيل المثال ، كان الجسيدات والنوتوكد مفرط الاستقطاب بشكل عام مقارنة بالأنسجة والأعضاء المجاورة. في جنين السمكة هذا البالغ من العمر يومين ، تظهر الأنشطة الكهربائية العصبية العضلية أثناء الحركة مع تغيرات في كثافة اللون المقابلة لنقل الإشارات الكهربائية.تم فحص الخصائص الكهربائية الحيوية للخلايا السرطانية في أجنة من تهجينات أسماك مراسل ASAP1 مع طفرة RPL35 المعرضة ل MPNST التلقائي. بالمقارنة مع الأنسجة المحيطة ، كانت الخلايا السرطانية أكثر استقطابا. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء تقنية الحقن الدقيق هذه في حوالي ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن أجنة الزرد يجب أن تكون في مرحلة الخلية الواحدة للحصول على نتائج مثالية. مع تطورها ، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأحياء التنموي وبيولوجيا الخلية لاستكشاف تغيرات الإشارات الكهربائية في الجسم الحي في أسماك الزرد والكائنات الحية النموذجية الأخرى. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء خط سمك الزرد المعدلة وراثيا عن طريق الحقن الدقيق.

visualization-cellular-electrical-activity-zebrafish-early-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

علم الأحياء النمائي

في هذا الفيديو ، ونحن يبرهن على وجود طريقة يمكن من خلالها تحليل الدماغ النامي في أجنة الفقاريات الزرد يعيش في قرار خلية واحدة بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. ويشمل هذا الأسلوب الذي كنا حقن الجنين الزرد وحيدة الخلية وجبل لاحقا وصورة الدماغ النامي.

يعيش تصوير الدماغ الجنينية اسماك الزرد بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر

يصف هذا البروتوكول التصوير من الخلايا العصبية الفردية أو الخلايا العصبية في قمة العيش الأجنة الزرد. ويستخدم هذا الأسلوب لدراسة سلوكيات الخلوية والتوطين أكتين باستخدام مضان مبائر الوقت الفاصل بين المجهري.

يعيش التصوير في القدرة على الحركة والهيكل الخلوي أكتين خلية من الخلايا العصبية الفردية والخلايا العصبية في الأجنة كريست اسماك الزرد

يوضح هذا الفيديو طريقة تستفيد من الجمع بين التثقيب الكهربائي والمجهر البؤري لإجراء تصوير حي لخلايا عصبية سلفية فردية في الدماغ الأمامي لسمكة الزيبرا النامية. ويمكن من خلال هذه الطريقة إجراء تحليل In vivo لتطور الخلايا العصبية السلفية في الدماغ الأمامي على مستوى استنساخي.

الوقت الفاصل بين التصوير حية من خلايا ذات صلة Clonally السلف العصبية في الدماغ المقدم اسماك الزرد النامية

المصدر: Williams, A. L., et al. تصوير الفوتون متعدد الفوتون لتصور التطور في الوقت الفعلي: تصور خلايا القمة العصبية المهاجرة في أجنة أسماك الزرد. J. Vis. Exp. (2017)}يعرض هذا الفيديو بروتوكول تصوير بفاصل زمني متعدد الفوتون لتصور هجرة خلايا القمة العصبية في جنين الزرد في الوقت الفعلي بدقة عالية.

تصور هجرة خلايا القمة العصبية في جنين الزرد باستخدام التصوير بفاصل زمني متعدد الفوتون

ووصف طريقة بسيطة لتسجيل إمكانات حقل خارج الخلية في الدماغ الأمامي الزرد اليرقات. الأسلوب يوفر...

الدماغ الأمامي تسجيل الكهربية في الزرد اليرقات

يوصف التصوير التنمية الدماغية في الزرد اليرقات. كما يتم توفير التقنيات اللازمة لتسهيل 3D التصوير وتعديل وضع الدماغية باستخدام العلاجات الكيميائية.

التصوير والإعمار 3D من الهياكل الدماغية في الجنينية اسماك الزرد

تسمح البروتوكولات الموضحة &gt;jove_content&lt;هنا بدراسة الخصائص الكهربائية للخلايا القابلة للإثارة في أكثر الظروف الفسيولوجية غير الغازية من خلال استخدام أجنة أسماك الزرد في نظام في الجسم الحي جنبا إلى جنب مع مؤشر الجهد المشفر وراثيا القائم على نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET) الذي يتم التعبير عنه بشكل انتقائي في نوع الخلية محل الاهتمام.

بيوسنسينغ موتور الخلايا العصبية الغشاء المحتملة في الأجنة الزرد الحية

توضح هذه المخطوطة طرق التسجيلات الكهربية من الخلايا العصبية في العمود الفقري من الأجنة الزرد واليرقات. إعداد يحافظ على الخلايا العصبية في الموقع وغالبا ما ينطوي على الحد الأدنى تشريح. تسمح هذه الطرق لدراسة الكهربية من مجموعة متنوعة من الخلايا العصبية في العمود الفقري، من الأولي للاكتساب استثارة الكهربائية من خلال مراحل اليرقات في وقت مبكر.

الزرد<em&gt; في الموقع</em&gt; الحبل الشوكي التحضير للتسجيلات الكهربية من العمود الفقري الحسية والحركية العصبية

في التصوير الحي هو أداة قوية يمكن استخدامها للتحقيق في الآليات الخلوية الكامنة وراء تطوير الجهاز العصبي. هنا نحن نصف تقنية لاستخدام الوقت الفاصل الكونستوب المجهري لتصور أعداد كبيرة من الخلايا متعددة الألوان بقوس قزح المسمى في الوقت الحقيقي داخل الجهاز العصبي حمار وحشي النامية.

تصور الدماغ النامية في سمك الحمار الوحشي المعيشة باستخدام Brainbow والوقت الفاصل Confocal التصوير

هنا نقدم طريقة لتصوير الدماغ الجنيني حمار وحشي في الجسم الحي حتى اليرقات ومراحل الأحداث. هذا الإجراء المجهري، مقتبس من النهج الكهربية، ويوفر الوصول إلى التفاصيل الخلوية ودون الخلوية من الخلايا العصبية الناضجة ويمكن الجمع بينها وبين علم الوراثة البصرية والدراسات الدوائية العصبية لتوصيف وظائف الدماغ والتدخل المخدرات.

في التصوير الحي لأنسجة الدماغ النشطة بالكامل في يرقات حمار وحشي مستيقظا والأحداث عن طريق إزالة الجمجمة والجلد

نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لفحص النشاط العصبي في مناطق الدماغ لأسماك الزرد المعدلة وراثيا التي تعبر عن مؤشرات الكالسيوم GCaMP باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر.

في الجسم الحي التصوير الفلوري متحد البؤر للنشاط العصبي الناجم عن التحفيز الحسي في يرقات الزرد المقيدة جزئيا

اكتشف طريقة تصور التغيرات الكهربائية الخلوية في أجنة الزرد باستخدام خطوط Danio rerio المعدلة وراثياً. تتيح هذه التقنية تتبع الإشارات الكهربائية في الوقت الفعلي لدراسة التطور الجنيني وتكوين الأورام.

التصور للنشاط الكهربائي الخلوية في الزرد الأجنة في وقت مبكر، والأورام

استكشف المزيد من الفيديوهات