التصور للنشاط الكهربائي الخلوية في الزرد الأجنة في وقت مبكر، والأورام

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء خط أسماك الزرد المعدلة وراثيا يسمح بمراقبة التغيرات الكهربائية الخلوية أثناء التطور الجنيني وحركة اليرقات وتكوين الورم. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات علم الأحياء التنموي وعلم وظائف الأعضاء وبيولوجيا الخلايا السرطانية مثل ما هي الأدوار الأساسية للإشارات الكهربائية الخلوية أثناء التطور الجنيني وفي الخلايا السرطانية؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح لنا بتتبع الإشارات الكهربائية الخلوية في الجسم الحي وفي الوقت الفعلي.

بعد تحضير Tol2 transposase mRNA ومحلول الحقن وفقا لبروتوكول النص ، بعد ظهر اليوم قبل الحقن ، قم بإعداد أربعة إلى ستة خزانات تكاثر مع اثنين على الأقل من الذكور واثنتين من الإناث. لتقليل كمية نفايات الأسماك وتحفيز استجابة التكاثر ، تجنب إطعام الأسماك في فترة ما بعد الظهر. في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة محلول الحقن المحضر من الفريزر سالب 80 درجة مئوية وضعه على الثلج.

اسحب الفواصل في أحواض تربية الأسماك واترك الأسماك تتزاوج. بشكل عام ، تضع الأسماك البيض في غضون 20 إلى 30 دقيقة. أثناء الانتظار ، باستخدام مجتذب ماصة دقيقة مع المعلمات التالية ، اسحب الإبر من الزجاج الشعري.

استخدم منديل مختبري لكسر نهاية الإبرة وإنشاء حافة مشطوفة. يفضل قطر أصغر لتقليل وفيات الأجنة. بمجرد أن تضع الأسماك البيض ، اجمعها في طبق بتري قطره 10 سم.

مباشرة تحت مجهر التشريح ، قم بإزالة جميع الأجنة غير الطبيعية ونفايات الأسماك. ثم ماصة الأجنة المخصبة في قالب حقن الاغاروز المحضر بنسبة 3٪. قم بإزالة الماء الزائد للمساعدة في الحفاظ على الأجنة في مكانها.

بمجرد أن تمتلئ جميع الصفوف بأجنة قابلة للحياة ، قم بترتيبها بحيث يتم توجيه جميع الخلايا المفردة بزاوية 45 درجة أفقيا فيما يتعلق بالإبرة. هذا سيجعل الحقن أسهل بكثير في وقت لاحق. بعد ذلك ، أثناء ارتداء القفازات ، استخدم طرف ماصة تحميل سعة 20 ميكرولتر لإزالة خمسة ميكرولترات من الهيكل المحضر من الأنبوب الموجود على الجليد.

أدخل طرف الماصة بحذر في الطرف الخلفي للأنبوب الشعري المكسور حيث يبدأ في الاستدقاق للحصول على الكاشف بالقرب من الحافة قدر الإمكان وطرده في الشعيرات الدموية. إذا كانت لا تزال هناك فقاعات هواء ، فقم بهز الإبرة مع التأكد من عدم كسر الحافة. أدخل الإبرة مباشرة في حامل إبرة الحقن الدقيق وشدها بعناية حتى تبقى الإبرة في مكانها.

ثم اضبط الزاوية على حوالي 45 درجة. بمجرد تحضير الإبرة وتثبيتها ، قم بتشغيل المجهر وخزان ضغط الغاز. اضبط حجم الحقن باستخدام ما يقرب من 0.5 رطل لكل بوصة مربعة للتثبيت و 30 رطل لكل بوصة مربعة للطرد.

تأكد من خروج المحلول من الإبرة عند الضغط على الدواسة. باستخدام ميكرومتر المرحلة مع قطرة من الزيت المعدني ، اضبط حجم وتدفق المحلول إلى قطر 10 ميكرومتر تقريبا. تأكد من أن الضغط الخلفي يسمح بكمية صغيرة من المحلول بالتنقيط من الإبرة.

إذا لم يكن هناك ضغط خلفي كاف ، فإن العمل الشعري سيؤدي إلى دخول السائل إلى الإبرة وتدمير الرنا المرسال. بمجرد معايرة الإبرة ، أدخل الإبرة في الخلية المفردة للأجنة المخصبة باستخدام حافة شق الجل لتوفير دعامة تحافظ على الجنين في مكانه وتسمح للإبرة بالضغط دون تحريك الجنين. بمجرد أن يصبح طرف الإبرة في الخلية المفردة ، اضغط على الدواسة لتحرير الكمية المطلوبة من المحلول.

من المهم حقن المحلول في الخلية ، وليس صفار البيض ، لتوليد سمك الزرد المعدل وراثيا. كرر هذه العملية لجميع الأجنة. عند الانتهاء ، استخدم ماصة نقل 3.4 مل ومياه نظام الأسماك لنقل الأجنة المحقونة إلى طبق مصنف عن طريق شطفها من شق الاغاروز.

قم بتخزين الأجنة في حاضنة 28.5 درجة مئوية للسماح لها بالنمو. تحقق مرة أخرى على مدار اليوم لإزالة أجنة الأسماك الميتة واستبدال الماء ب 0.1٪ ميثيلين بلو في ماء السمك. بعد حوالي ست إلى ثماني ساعات من الحقن ، استخدم 10 أجنة أسماك محقونة وطريقة hotshot لتحضير الحمض النووي الجيني.

في صباح اليوم التالي ، استخدم مجهر تشريح بمصدر ضوء فلوري لفرز الأجنة التي تظهر GFP في الأنسجة غير الصفار. يجب أن تحتوي هذه الأجنة على البنية المحقونة. قم بإجراء اختبار المكوس Tol2 للتحقق من نشاط الينقولات كما هو موضح سابقا.

إذا أمكن اكتشاف البلازما المستخلصة ، احتفظ بأجنة الأسماك المحقونة وقم بتربيتها. خلاف ذلك ، كرر عملية توليف Tol2 mRNA وعملية الحقن الدقيق حتى تحقق نتائج إيجابية من اختبار الضريبة Tol2. لتصوير أجنة الزرد ، تتقاطع بين الأسماك المؤسسية متعددة الجيل F2 مع الأسماك البرية في أزواج فردية.

اجمع أجنة الأسماك في مراحل النمو المختلفة المرغوبة وفقا لدليل التدريج لسمك الزرد. بالنسبة لأجنة الأسماك في المرحلة المبكرة في مياه نظام الأسماك ، تحت نطاق التشريح ، استخدم زوجا من الملقط لتقشير المشيمات وإزالتها بعناية. استخدم ماصة نقل التخلص لنقل عدد قليل من الأجنة إلى شريحة زجاجية مقعرة تحتوي على 3٪ ميثيل السليلوز.

ثم باستخدام إبرة أسفل نطاق التشريح ، اضبط الأجنة على المواضع المطلوبة لعرض نشاط GFP الخلوي. بالنسبة للأجنة في مرحلة أقل من 12 جسيمة ، استخدم مجهر مركب epifluorescence مع كاميرا متوافقة وبرنامج للتصوير. بالنسبة للأجنة التي تجاوزت مرحلة 12 جسيمة ، استخدم مجهر تشريح الفلورة.

لتصوير جهد الخلايا السرطانية ، حدد أولا الأسماك المصابة بأورام غمد الأعصاب المحيطية الخبيثة أو MPNST. ضع السمكة في طبق بتري قطره 10 سم وقم بإجراء تصوير كامل للتركيب. أخيرا بعد التصوير ، قم بتشريح الورم قبل عرض النشاط الكهربائي للخلية السرطانية.

في الحقن الناجح ، سيظهر أكثر من 50٪ من الأجنة المحقونة درجة معينة من GFP في الخلايا الجسدية وسيظهر معظمها نتيجة إيجابية من مقايسة الينقولات Tol2. هنا تم فحص التغيرات المحتملة للغشاء طوال دورة الخلية أثناء التطور الجنيني المبكر لأسماك الزرد. كما رأينا في هذا الفيديو بفاصل زمني ، فرط استقطاب الخلايا قبل تكوين ثلم الانقسام.

علاوة على ذلك ، أظهرت الأنسجة المختلفة مجموعة متنوعة من إمكانات الغشاء في أجنة الأسماك التي يبلغ عمرها يوما إلى ثلاثة أيام. على سبيل المثال ، كان الجسيدات والنوتوكد مفرط الاستقطاب بشكل عام مقارنة بالأنسجة والأعضاء المجاورة. في جنين السمكة هذا البالغ من العمر يومين ، تظهر الأنشطة الكهربائية العصبية العضلية أثناء الحركة مع تغيرات في كثافة اللون المقابلة لنقل الإشارات الكهربائية.

تم فحص الخصائص الكهربائية الحيوية للخلايا السرطانية في أجنة من تهجينات أسماك مراسل ASAP1 مع طفرة RPL35 المعرضة ل MPNST التلقائي. بالمقارنة مع الأنسجة المحيطة ، كانت الخلايا السرطانية أكثر استقطابا. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء تقنية الحقن الدقيق هذه في حوالي ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن أجنة الزرد يجب أن تكون في مرحلة الخلية الواحدة للحصول على نتائج مثالية. مع تطورها ، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأحياء التنموي وبيولوجيا الخلية لاستكشاف تغيرات الإشارات الكهربائية في الجسم الحي في أسماك الزرد والكائنات الحية النموذجية الأخرى. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء خط سمك الزرد المعدلة وراثيا عن طريق الحقن الدقيق.