Name: تقييم أثر تراكم البروتين في الأكسدة الخلوية في الخميرة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: اكتشف تقييم تأثير تراكم البروتين على الإجهاد التأكسدي الخلوي باستخدام الخميرة Saccharomyces cerevisiae. تُستخدم تقنية التدفق الخلوي لتحليل حالات البروتينات القابلة للتكتل وعلاقتها بالأكسدة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1-الثقافات S. cerevisiae والتعبير البروتين
ملاحظة: متغيرات Aβ يحمل المزيف التجميع نسبية مختلفة بسبب طفرة في رواسب واحدة في موقف الببتيد Aβ42 (الشكل 1A) 19 (Phe19). هذه المتغيرات الببتيد الموسومة بالبروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل)، الذي يعمل ك مراسل (الشكل 1) تجميع29.
<ol><li>تحويل والبلازميدات الترميز للمتغيرات Aβ42-بروتينات فلورية خضراء 20 في خلايا الخميرة مع BY4741 خلفية أبوية (ماتا له3Δ1 لوي2Δ0 التقى15Δ0 ura3Δ0)30. بلازميد كل ترميز للمسخ Aβ42 تنصهر للتجارة والنقل برابط جسجسج. البلازميدات pESC(-URA) وتشمل علامة التحديد URA329.<ol>
<li>إعداد متوسطة كاملة الاصطناعية دون اليوراسيل (SC-اتفاق جولة أوروغواي) مع المكونات التالية: 1.9 غرام/لتر النيتروجين الخميرة قاعدة دون اليوراسيل و 5 غرام/لتر كبريتات الأمونيوم 900 مل ddH2س جنبا إلى جنب مع 100 مل السكر 20% (w/v).</li>
		<li>وضع مستعمرة واحدة من خلايا الخميرة المحولة إلى 20 مل المتوسط SC-اتفاق جولة أوروغواي الذي يحتوي على 2% جلوكوز وتنمو الثقافات بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية تحت الانفعالات 210 لفة في الدقيقة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>في اليوم التالي، تنمو الثقافات خلايا الخميرة الجديدة بتطعيم 100 ميليلتر للثقافة بين عشية وضحاها إلى 5 مل من الطازجة SC-أورا المتوسطة.</li>
	<li>في OD590 0.5، الطرد المركزي الثقافات في ز س 3,000 لمدة 4 دقائق وتجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في نفس الحجم من المتوسطة SC-أورا الطازجة التي تحتوي على رافينوسي 2%.</li>
	<li>احتضان عند 30 درجة مئوية تحت الانفعالات 210 لفة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. ثم الطرد المركزي الخلايا في 3,000 غ س ل 4 دقيقة وتجاهل المادة طافية. ريسوسبيند الخلايا في المتوسطة SC-أورا الطازجة التي تحتوي على اللبن 2% للحث على تعبير البروتين المؤتلف.</li>
	<li>بعد 16 ساعة من حمل التعبير البروتين في مقرر اتفاقية استكهولم--أورا المتوسطة التي تحتوي على اللبن 2%، الحصاد 1 مل الخلايا المستحثة في أنابيب ميكروسينتريفوجي العقيمة بالطرد المركزي في 3,000 ز س لمدة 4 دقائق. ملاحظة: تحدث الاختلافات الأكثر صلة بالموضوع بعد فترة التعريفي لخلايا الخميرة تسبب حاء 16 التعبير عن المتغيرات Aβ42-التجارة والنقل يمكن تصور بالأسفار الفحص المجهري لتحديد توزيع المؤتلف البروتين داخل الخلايا (الشكل 2).</li>
</ol>2-خلية تلطيخ
ملاحظة: الخلايا المستحثة بغير جديدة مطلوبة كعنصر تحكم سلبية لتحديد عتبة فلورسنت أثناء تحليل FC.
<ol><li>خلايا الخميرة التي يسببها ح 16 وتحديد كثافتها الضوئية في 590 نانومتر (OD590). تمييع لهم في الملحية فوسفات عقيمة مخزنة (PBS) ل التطوير التنظيمي590 من 0.1.<ol>
<li>إعداد 1 × المالحة الفوسفات مخزنة على النحو التالي: أضف 8 جم من كلوريد الصوديوم، 0.2 جم بوكل، ز 1.44 غ2هبو4، وملء 0.24 ز خ2ص4 إلى 800 مل ddH2سين الحل ما يصل إلى 1 لتر من ddH2س بعد ضبط ال pH إلى 7.4 مع HCl. تصفية المخزن المؤقت عن طريق فلتر 0.2 ميكرون.</li>
	</ol>
</li>
	<li>نقل تعليق خلية وإذ تعرب عن أنابيب مناسب المسمى (12 × 75 مم مستديرة القاع البوليستيرين) وحمايتهم من الضوء. تأكد من أنهم على استعداد ليتم تحميلها على سيتوميتير تدفق للتحليل، جنبا إلى جنب مع الخلايا المستحثة بغير وغير الملون.</li>
	<li>إضافة المسبار الأكسدة (مثلاً، سيلروكس الأحمر العميق) لكل عينة في تركيز نهائي من 5 ميكرومتر واحتضان الخلايا عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام.</li>
	<li>بعد الحضانة، تغسل الخلايا 3 مرات مع 1 x PBS وريسوسبيند لهم في نفس حجم المخزن المؤقت قبل التحليل بنادي.</li>
</ol>3-التدفق الخلوي التحليل
ملاحظة: استخدام إعداد FC أشعة الليزر المناسبة ومرشحات، والكشف عن بروتينات فلورية خضراء والأكسدة مسبار fluorescence إشارة. يمكن استخدام سيتوميتير تدفق مجهزة 488 نانومتر أزرق ليزر للكشف عن بروتينات فلورية خضراء وليزر نانومتر أحمر 635 للكشف عن الأكسدة مسبار الأسفار. يتم الحصول على انبعاث الأسفار للتجارة والنقل، ومسبار الأكسدة مع عامل تصفية 530/30 نانومتر BP وعامل تصفية شركة بريتيش بتروليوم 660/20، على التوالي (الجدول 1).
<ol><li>انقر فوق فتح لوحة ورقة عمل جديدة وخلق المؤامرات دوت اقتناء التالية.<ol>
<li>حدد أداة مؤامرة مبعثر من شريط الأدوات وإنشاء مؤامرة مع المتغيرات الجانب مبعثر-المنطقة (SSC-أ) على المحور الصادي مقابل مبعثر ناحية الأمام (منتدى التعاون الأمني-أ) في مقياس خطي على المحور س.</li>
		<li>انقر فوق مبعثر مؤامرة أداة من شريط الأدوات وخلق مؤامرة مع المتغيرات FL1-منطقة (فيتك) على المحور ص. FL3-منطقة (APC) في مقياس لوغاريتمي على المحور ص.</li>
	</ol>
</li>
	<li>انقر فوق رمز إعدادات الصكوك . انقر فوق علامة التبويب التعويض وتعيين جميع مستويات التعويض. انقر فوق علامة التبويب اقتناء وحدد عدد إجمالي من 20,000 الأحداث التي سيتم تسجيلها.</li>
	<li>انقر فوق رمز معدل التدفق للتبديل معدل التدفق إلى منخفض.</li>
	<li>انقر فوق علامة التبويب الحصول على بدء تشغيل الخلايا المستحثة بغير، أونستاينيد وضبط الجهد في إعدادات صك من الأمام والجانب المبعثر حتى يتم توزيع السكان في الربع السفلي الأيمن الأوسط.<ol>
<li>انقر على أيقونة مضلع تعيين منطقة R1 حول السكان الخلية باستثناء خلية الحطام، واستخدام هذه الفئة من السكان بوابة P1 = R1 لجميع المؤامرات نقطة مضيئة وتمثيلات الرسم البياني (الشكل 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>لضبط الجهد PMT إشارة الأسفار، تشغيل الخلايا أونستاينيد في المؤامرة دوت FL1-FL3، ضبط المكاسب في التبويب إعداد الصك ، حتى يتم توزيع الخلايا في الربع الأيسر السفلي.</li>
	<li>تغيير العينة في الخلايا المستحثة لقياس fluorescence التجارة والنقل. في التبويب إعداد الصك ، تعيين المكسب في منتدى التعاون الأمني، مقابل FL1 (فيتك) عندما يتم توزيع السكان في الربع الأيسر السفلي. تعريف السكان خلية إيجابي مع بوابة (بوابة P2).</li>
	<li>تغيير العينة لعدم فعل الملون الخلايا لعرض الأكسدة بالأسفار في مؤامرة دوت FL3 (APC) منتدى التعاون الأمني مقابل . ضبط المكاسب حتى يتم توزيع السكان خلية في الربع العلوي الأيسر. بوابة سكان الخلية إيجابية P3.</li>
	<li>جعل قطعتي الرسم البياني مع الرمز المدرج التكراري لتمثيل fluorescence الخلية. لتمثيل شدة الأسفار، تأكد من FL1 (فيتك) تمثل الأسفار بروتينات فلورية خضراء في المحور س، و FL3 (APC) تمثل الأسفار في المحور الصادي، تطبيق السكان P2 و P3 في مقياس لوغاريتمي، على التوالي. ملاحظة: الرسم البياني تراكبات طريقة جيدة لتوضيح الاختلافات بين ملفات تعريف صف خلايا معربا عن متغيرات Aβ المختلفة.</li>
</ol>4-المؤتلف البروتين إيمونوديتيكشن
<ol><li>لتحديد مستويات التعبير البروتين، حصاد ثقافات الخميرة الناجمة عن الطرد المركزي في س 4,000 ز 6 دقيقة عن ح 16، وتخزين الكريات الخلية في-80 درجة مئوية.<ol>
<li>ريسوسبيند الخلايا المجمعة معربا عن البروتين المؤتلف ح 16 في برنامج تلفزيوني. إعداد 200 تعليق خلية ميليلتر من كل متحولة Aβ42-التجارة والنقل ل التطوير التنظيمي590 من 20.</li>
	</ol>
</li>
	<li>لتحليل الكسر البروتين الكلي، حصد 100 ميليلتر من كل متحولة بالطرد المركزي في س 14,000 ز لمدة 20 دقيقة وريسوسبيند الكريات خلية في نفس حجم المخزن المؤقت لتحلل الخميرة Y-الواحدة (50 مم تريس-HCl pH 8.0، 1% [دمس]، 200 ملم كلوريد الصوديوم، يدتا 1 ملم تحتوي على 10 ملغ/مل SB3-14 (myr سولفوبيتيني إيستيل) وتستكمل مع فلوريد فينيلميثيلسولفونيل 1 مم (بمسف)).<ol>
<li>احتضان العينات عن 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تحت الانفعالات معتدل.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تحديد تركيز استخراج البروتين باستخدام مقايسة برادفورد. تحميل تصل إلى 5 ميكروغرام لاستخراج البروتين من كل عينة على جل التفريد الحزب الديمقراطي الصربي صفحة الاكريلاميد 15% ووصمة عار على غشاء ثنائي الفلوريد (PVDF) الفينيليدن في 100 الخامس لمدة 60 دقيقة.<ol>
<li>إعداد برادفورد حله في 50 مل إيثانول 95% كاشف مع 100 مغ G-250 "أخذ الأزرق الرائعة" وإضافة 100 مل حامض الفوسفوريك 85% (w/v). ثم، عندما يتم حل الصبغة تماما، تمييع المخلوط مع ddH2س إلى 1 لتر وتصفيته من خلال ورق الترشيح السيليلوز فقط قبل استخدام. ملاحظة: الكاشف برادفورد وينبغي أن يكون الضوء براون.</li>
		<li>إعداد معيار ألبومين المصل البقري (BSA) تتراوح ما بين 5-100 ميكروغرام من البروتين في ميليلتر 1,000 للكاشف برادفورد.</li>
		<li>إضافة 1-10 ميليلتر بروتين استخراج إلى 1 مل الكاشف برادفورد واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.</li>
		<li>قياس امتصاص المعايير واستخراج عينات في التطوير التنظيمي595من البروتين.</li>
		<li>للتحليل، وجعل مؤامرة مع امتصاص القيم التي تم الحصول عليها للمعايير مقابل. ميكروغرام بروتين. اعتماداً على المنحنى المعياري، تحديد تركيزات عينات الأصلي من كمية البروتين، نظراً لحجم وتمييع، أن وجدت.</li>
	</ol>
</li>
	<li>شطف الغشاء مع 1 × تريس مخزنة المالحة (تبس)، 0.1% 20 توين (تتبس)، وحظر استخدام اللبن المجفف الخالي 5% (w/v) في 1 x TTBS.<ol>
<li>لتحضير 1 لتر 10 x TBS، حل ز 24 من قاعدة تريس و 88 جرام من كلوريد الصوديوم في 900 مل ح2سدد وضبط درجة الحموضة إلى 7.6. إضافة ddH2س إلى وحدة تخزين نهائي للأم 1 لحل 1 x، مزيج الجزء 1 من 10 x الأسهم مع 9 أجزاء من ddH2o.</li>
	</ol>
</li>
	<li>احتضان الغشاء ح 1 مع 1:1,000 6E10 تضعف جسم بيتا-اميلويد الأولية، وعن ح 1 في درجة حرارة الغرفة مع عنزة جسم ثانوية تضعف الماوس المضادة مفتش HRP المتقارن 01:10، 000.</li>
	<li>وضع 1 مل كاشف فلوري لوميناتا باستخدام الأغشية وتحديد نطاقات بتحليل دينسيتوميتريك كما هو موضح في الخطوة 5، 2.</li>
</ol>5-بيانات التحليل
<ol><li>لتحليل البيانات التي تم الحصول عليها من لجنة التيسير، إنشاء جدول عرض متوسط كثافة الفلورسنت (MFI) والأسفار الوسيط مع الخطأ القياسي الخاص به المطابق و/أو معامل التباين (CV) للأسفار بروتينات فلورية خضراء ومستويات الأكسدة.<ol>
<li>انقر فوق علامة التبويب المفتش والرمز الإحصاءات لتخصيص البيانات الإحصائية المطلوبة لكل قناة. ملاحظة: عند مقارنة المتغيرات البروتين، تحويل بيانات القيم الأسفار إلى خلفية أكثر من إضعاف أو القرار متري (RD): <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57470/57470eq1.jpg"> في هذا المقياس، متوسط العينة هو الأسفار يعني المشكلة عينات مراقبة يعني fluorescence متوسط الخلايا المستخدمة كعنصر تحكم و SD هو الانحراف المعياري للأسفار يعني. عامل RD مؤشر أكثر دقة من قيمة مؤسسة مونتانيار، فإنه ليس فقط بحساب الفرق بين العينات ولكن أيضا حسابات لنشر البيانات. هذا الحساب على وجه التحديد ذات الصلة عند مقارنة البيانات الواردة من مختلف التجارب التي نفذت على مر الزمن. مرة واحدة قد حسبت طلقة، المستحسن استخدام الاختبار الإحصائي لتأكيد أهمية الاختلافات الملحوظة بين الخيارين البروتين.</li>
	</ol>
</li>
	<li>للبروتين إيمونوديتيكشن، قياس مستويات البروتين المؤتلف بوصمة عار الغربية باستخدام البرمجيات إيماجيج.<ol>
<li>قبل تحليل قياس كثافة، تحويل الصور الخام الأصلي للغشاء نمواً في وضع اللون الرمادي وتنسيق ملف JPEG.</li>
		<li>ضبط المقطع تعيين قياسات القائمة تحليل تعني قيمة الرمادي.</li>
		<li>انقر فوق الأداة مستطيل من إيماجيج وتعريف منطقة الاهتمام (ROI) بحجم متسقة لتحليل قياس كثافة الفرقة. مركز كل الفرقة على صورة غشاء داخل إطار مستطيل تم إنشاؤه وسجل القياس واحداً تلو الآخر باستخدام Ctrl + M (الأمر القياس).</li>
		<li>قياس الخلفية المحلية المجاورة لكل الفرقة، وتطبيق نفس المنطقة العائد على الاستثمار. بعد القياس، طرح الخلفية المحلية المناظرة من كل الفرقة الفردية.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Frydman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+newly+translated+proteins+in+vivo%3A+the+role+of+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones.</a> Annual Review of Biochemistry. 70, 603-647 (2001).</li>
<li>Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+chaperones+in+protein+folding+and+proteostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular chaperones in protein folding and proteostasis.</a> Nature. 475, 324-332 (2011).</li>
<li>Wong, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+selective+clearance+of+protein+inclusions+by+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of selective clearance of protein inclusions by autophagy.</a> Nature Communications. 3, (2012).</li>
<li>Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone+networks+in+protein+disaggregation+and+prion+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation.</a> Journal of Structural Biology. 179, 152-160 (2012).</li>
<li>Glickman, M. H., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway%3A+destruction+for+the+sake+of+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction.</a> Physiological Reviews. 82, 373-428 (2002).</li>
<li>Dobson, C. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12181546">Getting out of shape.</a> Nature. 418, 729-730 (2002).</li>
<li>Chiti, F., Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding%2C+functional+amyloid%2C+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding, functional amyloid, and human disease.</a> Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).</li>
<li>Aguzzi, A., O'Connor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+diseases%3A+pathogenicity+and+therapeutic+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation diseases: pathogenicity and therapeutic perspectives.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 9, 237-248 (2010).</li>
<li>Rapezzi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transthyretin-related+amyloidoses+and+the+heart%3A+a+clinical+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Transthyretin-related amyloidoses and the heart: a clinical overview.</a> Nature Reviews Cardiology. 7, 398-408 (2010).</li>
<li>Deas, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+oligomers+interact+with+metal+ions+to+induce+oxidative+stress+and+neuronal+death+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein oligomers interact with metal ions to induce oxidative stress and neuronal death in Parkinson's disease.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 24, 376-391 (2016).</li>
<li>Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+transmission+of+protein+aggregates+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 301-307 (2010).</li>
<li>Frost, B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+mechanisms+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 155-159 (2009).</li>
<li>Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+body+formation+reduces+levels+of+mutant+huntingtin+and+the+risk+of+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death.</a> Nature. 431, 805-810 (2004).</li>
<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opinion%3A+what+is+the+role+of+protein+aggregation+in+neurodegeneration%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Opinion: what is the role of protein aggregation in neurodegeneration?</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 891-898 (2005).</li>
<li>Mishra, R., Sjölander, D., Hammarström, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectroscopic+characterization+of+diverse+amyloid+fibrils+in+vitro+by+the+fluorescent+dye+Nile+red%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Spectroscopic characterization of diverse amyloid fibrils in vitro by the fluorescent dye Nile red.</a> Molecular BioSystems. 7, 1232-1240 (2011).</li>
<li>Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+amyloid+by+congo+red+spectral+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Quantifying amyloid by congo red spectral shift assay.</a> Methods in Enzymology. 309, 285-305 (1999).</li>
<li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+why+cook+with+baker%27s+yeast%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast?</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 436-449 (2010).</li>
<li>Tenreiro, S., Outeiro, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+is+good%3A+yeast+models+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">Simple is good: yeast models of neurodegeneration.</a> FEMS Yeast Research. 10, 970-979 (2010).</li>
<li>Moosavi, B., Mousavi, B., Macreadie, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+model+of+amyloid-%CE%B2+and+Tau+aggregation+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Yeast model of amyloid-β and Tau aggregation in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 47, 9-16 (2015).</li>
<li>Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+power+of+yeast+to+unravel+the+molecular+basis+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration.</a> Journal of Neurochemistry. 127, 438-452 (2013).</li>
<li>Yang, J., Hao, X., Cao, X., Liu, B., Nyström, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+sequestration+and+detoxification+of+huntingtin+by+the+ribosome+quality+control+complex%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Spatial sequestration and detoxification of huntingtin by the ribosome quality control complex.</a> eLife. 5, (2016).</li>
<li>Braun, R. J., Büttner, S., Ring, J., Kroemer, G., Madeo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nervous+yeast%3A+modeling+neurotoxic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nervous yeast: modeling neurotoxic cell death.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35, 135-144 (2010).</li>
<li>Figley, M. D., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+genetic+screen+reveals+novel+therapeutic+strategy+for+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Rare+Diseases%22%5BJournal%5D)">Yeast genetic screen reveals novel therapeutic strategy for ALS.</a> Rare Diseases. 1, e24420(2013).</li>
<li>Cooper, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson%27s+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313, 324-328 (2006).</li>
<li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model%3A+exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A yeast TDP-43 proteinopathy model: exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6439-6444 (2008).</li>
<li>Bharathi, V., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27654890">Use of ade1 and ade2 mutations for development of a versatile red/white color assay of amyloid-induced oxidative stress in saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 33, 607-620 (2016).</li>
<li>Pallarès, I., Ventura, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28685682">Advances in the prediction of protein aggregation propensity.</a> Current Medicinal Chemistry. , (2017).</li>
<li>Villar-Piqué, A., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+propensity+is+a+crucial+determinant+of+intracellular+inclusion+formation+and+quality+control+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation propensity is a crucial determinant of intracellular inclusion formation and quality control degradation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1833, 2714-2724 (2013).</li>
<li>Navarro, S., Villar-Piqué, A., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+against+toxic+aggregation-prone+protein+sequences+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Selection against toxic aggregation-prone protein sequences in bacteria.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1843, 866-874 (2014).</li>
<li>Morell, M., de Groot, N. S., Vendrell, J., Avilés, F. X., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+amyloid+protein+aggregation+and+yeast+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Linking amyloid protein aggregation and yeast survival.</a> Molecular BioSystems. 7, 1121-1128 (2011).</li>
<li>Conchillo-Solé, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AGGRESCAN%3A+a+server+for+the+prediction+and+evaluation+of+%26%2334%3Bhot+spots%26%2334%3B+of+aggregation+in+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">AGGRESCAN: a server for the prediction and evaluation of &#34;hot spots&#34; of aggregation in polypeptides.</a> BMC Bioinformatics. 8, 65(2007).</li>
<li>Fernandez-Escamilla, A. M., Rousseau, F., Schymkowitz, J., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+sequence-dependent+and+mutational+effects+on+the+aggregation+of+peptides+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Prediction of sequence-dependent and mutational effects on the aggregation of peptides and proteins.</a> Nature Biotechnology. 22, 1302-1306 (2004).</li>
<li>Renner, M., Melki, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24698014">Protein aggregation and prionopathies.</a> Pathologie Biologie.(Paris). 62, 162-168 (2014).</li>
<li>Carija, A., Navarro, S., de Groot, N. S., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+into+insoluble+deposits+protects+from+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation into insoluble deposits protects from oxidative stress.</a> Redox Biology. 12, 699-711 (2017).</li>
</ol>

مجموعة واسعة من أمراض ترتبط بتراكم البروتينات تجمعات في الرواسب الخلوية6،،من78،33. وقد بذلت جهود كثيرة لكشف الآليات الجزيئية التي تؤدي إلى ظهور هذه الأمراض باستخدام النهج الحسابية التي لا تأخذ بعين الاعتبار تركيزات البروتين، أو في المختبر النهج، الذي تركيز البروتين تبقى ثابتة أثناء عملية التفاعل. ومع ذلك، داخل الخلية، البروتينات باستمرار تصنيعه والتدهور في بيئة مزدحمة وغير متجانسة. وهذ...

بروتيوستاسيس هو أحد المحددات أساسية لخلية عمليات الشيخوخة واللياقة البدنية. في الخلايا، والمحافظة على التوازن البروتين بمراقبة جودة البروتين المتطورة شبكات تهدف إلى ضمان ريفولدينج الصحيح لتجمعات من البروتين كونفورميرس بمرافقين و/أو بهم proteolysis المستهدفة مع عدة آليات مصانة جيدا1 ،،من23،،من45. عدد كبير من الدراسات تقديم الدعم إلى الارتباط بين ظهور وتقدم مجموعة واسعة من الأمراض التي تصيب الإنسان وفشل بروتيوستاسيس، مما يؤدي إلى ميسفولدينج البروتين والتجميع. على سبيل المثال، وجود رواسب البروتين يعتبر علامة مميزة مرضية للعديد من اضطرابات الأعصاب، مثل الزهايمر، باركنسون، وهنتنغتون الأمراض6،7،8، أمراض بريونوجينيك، وأميلويدوسيس غير التنكسية9. يقترح أن أوائل الجمعيات أوليجوميريك وبروتوفيبريلار في رد فعل التجميع هي اليسيتورس الرئيسية من سيتوتوكسيسيتي، إقامة التفاعلات الشاذة مع غيرها من البروتينات في الوسط الخلوي مزدحمة10. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن ينتقل البروتين تضمينات (PI) بين الخلايا، ونشر11،التأثير السمي على12. ولذلك، يمكن أن يكون أن تشكيل بي قد تشكل في الواقع إليه ديتوكسيفينغ يقيد وجود الأنواع الخطرة المجمعة إلى مواقع محددة في الخلية، حيث يمكن معالجتها أو المتراكمة دون الآثار الجانبية الرئيسية 13 , 14.
القياسية في المختبر النهج البيوكيميائية قدمت أفكاراً هامة في مختلف الأنواع التي تعيش على تجميع ردود الفعل وعلى خصائص15،16. بيد أن الظروف المستخدمة في هذه الاختبارات بوضوح تختلف عن تلك التي تحدث داخل الخلية، والسؤال التالي، أهميتها الفسيولوجية. بسبب حفظ ملحوظة من المسارات الخلوية مثل مراقبة جودة البروتين، أوتوفاجي، أو تنظيم17،الدولة الأكسدة الخلوية18 بين حقيقيات النوى19،20،21 ،،من2223، برز مهدها الخميرة Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) كنموذج خلوية بسيطة متميز لدراسة محددات الجزيئية لتجميع البروتين وآثارها السامة للخلايا المرتبطة بها في البيئات ذات الصلة بيولوجيا24،،من2526.
الميل تجميع البروتين سمة ترميز أصلاً في التسلسل الرئيسي. وهكذا، يمكن التنبؤ تشكيل هياكل مثل اميلويد استناداً إلى تحديد وتقييم الفاعلية لتعزيز تجميع المناطق البروتينية27. ومع ذلك، رغم نجاح خوارزميات بيوينفورماتيك للتنبؤ بخصائص التجميع في المختبر لتسلسل البروتين، هم لا تزال أبعد ما تكون عن التنبؤ بكيفية ترجمة هذه الميول في فيفو تأثير السامة للخلايا. قد تساعد الدراسات التي تتناول العلاقة بين الدولة مجمعة بروتين معين وعن الأضرار الخلوية المرتبطة بها بطريقة منهجية للالتفاف حول هذا القيد الحسابي. تناولت هذه الدراسة، مع استفادة مجموعة كبيرة من المتغيرات من بيتا اميلويد الببتيد Aβ42 متباينة في رواسب واحد فقط، ولكن عرض نطاق متواصل من تجميع المزيف في فيفو28هذا الاتصال. على وجه الخصوص، يرد وصف لنهج القائم على التيسير لتحديد الأنواع conformational المحاسبة لأضرار الأكسدة بالبروتينات المعرضة للتجميع في خلايا الخميرة. المنهجية التي توفر العديد من المزايا مثل البساطة والقدرة الإنتاجية العالية، والقياس الكمي الدقيق. مكن هذا النهج لتأكيد أن تلعب بي بدور وقائي ضد الأكسدة.

<table><tbody><tr><td>خلايا الخميرة BY4741&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>201388</td><td>النمط الجيني: MATa his3 & Delta; 1 ليو2 ودلتا. 0 met15 & دلتا. 0 ura3 & دلتا ؛ 0</td></tr><tr><td>pESC (-Ura) البلازميد &nbsp ؛</td><td>Agilent Genomics</td><td>217454</td><td>بلازميد تعبير الخميرة مع محرك Gal. علامة قابلة للتحديد URA3</td></tr><tr><td>الخميرة الاصطناعية المتسربة المكملات الغذائية المتوسطة</td><td>Sigma</td><td>Y1501</td><td>مسحوق</td></tr> قاعدة <tr><td>نيتروجين الخميرة بدون أحماض أمينية Sigma</td><td></td><td>Y0626</td><td>مسحوق</td></tr><tr><td>Raffinose</td><td>Sigma</td><td>R7630</td><td>مسحوق</td></tr><tr><td>الجلوكوز</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>مسحوق</td></tr><tr><td>Galactose</td><td>Sigma</td><td>G0750</td><td>مسحوق</td></tr><tr><td>الفوسفات محلول ملحي مخزن (PBS)</td><td>فيشر Scientific</td><td>BP3991&nbsp;</td><td>الحل 10X</td></tr><tr><td>كاشف CellROX أحمر غامق&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>C10422</td><td>مستشعر الفلورسنت الثابت لخلية الجذور الحرة ، غير الفلوري أثناء وجوده في حالة مخفضة ، ويظهر تألق ساطع عند الأكسدة بواسطة أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، مع الحد الأقصى للامتصاص / الانبعاث عند 644/665 نانومتر.</td></tr><tr><td>كاشف استخلاص البروتين Y-PER&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>78990</td><td>عازلة تحلل الخلايا السائلة</td></tr><tr><td>أكريلاميد / Bis-acrylamide</td><td>Sigma</td><td>A6050</td><td>Solution</td></tr><tr><td>برادفورد صبغة كاشف</td><td>Bio-Rad &nbsp ؛</td><td>كاشف صبغة 5000205</td><td>لتحديد تركيز البروتين بخطوة</td></tr> واحدة <tr><td>& بيتا ؛ - الجسم المضاد للأميلويد 6E10 &nbsp ؛</td><td>BioLegend</td><td>803001</td><td>Mouse IgG1. تقع الحاتمة داخل الأحماض الأمينية 3-8 من بيتا أميلويد (EFRHDS).</td></tr><tr><td>الماعز المضادة للفأر IgG-HRP مترافقة&nbsp;</td>غشاء <td>1721011</td><td></td> <td>Bio-Rad</td></tr><tr><td>Immobilon-P ، PVDF</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Luminata forte</td><td>Merk</td><td>WBLUF0100</td><td>Premixed ، جاهز للاستخدام كاشف الكشف عن HRP الكيميائي</td></tr><tr><td>محلول فلوريد فينيل ميثان سولفونيل (PMSF)</td> <td>مثبط البروتياز Sigma</td><td>93482</td><td>. يذوب عند 0.1 متر في الإيثانول</td></tr><tr><td>FACSمقياس التدفق الخلوي &nbsp;</td>BD <td>Biosciences</td><td>657338</td><td>مجهزة ب 488 &nbsp ؛ ليزر أزرق نانومتر للكشف عن GFP ، و 635 & nbsp ؛ ليزر أحمر نانومتر / 530/30 نانومتر مرشح BP وفلتر 660/20 BP</td></tr><tr><td>خلية نقل الرحلان الكهربائي المصغرة Trans-Blot</td> نظام <td>نقل البروتين Bio-Rad</td><td>1703930</td> نظام <td>نقل</td></tr><tr><td>البروتين Mini-PROTEAN Tetra Handcast</td><td>Systems Bio-Rad</td><td>1658000FC</td> نظام <td>الرحلان الكهربائي</td></tr></tbody></table>

تقييم أثر تراكم البروتين في الأكسدة الخلوية في الخميرة

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

تم المتعلقة بالبروتين ميسفولدينج والتجميع في والتشكلات اميلويد إلى ظهور وتطور العديد من الأمراض الأعصاب. ومع ذلك، لا يزال هناك القليل من المعلومات حول بروتين غير قابل للذوبان كيف تمارس المجاميع التأثيرات السمية في فيفو. بسيطة بدائية وحقيقية النواة نموذج الكائنات، مثل البكتيريا والخميرة، ساهمت إلى حد كبير فهمنا الحالي للآليات وراء تشكيل اميلويد داخل الخلايا وإكثار المجاميع، وسمية. في هذا البروتوكول، وهو وصف استخدام الخميرة كنموذج تشريح العلاقة بين تشكيل المجاميع البروتين وأثرها على الأكسدة الخلوية. الأسلوب يجمع بين الكشف عن الدولة القابلة للذوبان أو تجميعها داخل الخلايا بروتين أميلويدوجينيك مع التقدير الكمي للأضرار الأكسدة الخلوية الناتجة عن التعبير عن استخدام التدفق الخلوي (FC). وهذا النهج بسيطة وسريعة، والكمية. وتوضح الدراسة التقنية طريق مضاهاة الأكسدة الخلوية الناتجة عن مجموعة كبيرة من بيتا اميلويد الببتيد المتغيرات مع ميول التجميع الجوهرية الخاصة بهم.

ويصف هذا البروتوكول كيفية توظيف مجموعة من المتغيرات 20 من الببتيد Aβ42 حيث قد تم تحور Phe19 إلى جميع الأحماض الأمينية الطبيعية قائمة28. يمكن تحليل ميول التراكم النظري لهذه البروتينات باستخدام اثنين من خوارزميات مختلفة بيوينفورماتيك (أجريسكان ورقصة التانغو من31،32). وفي كلتا الحالتين، يجعل هذا التحليل تدريجي تدرج الميول التجميع، يرجع، كقاعدة عامة، القيم القصوى للمخلفات مسعور وأقل منها مشحونة والقطبية (<stron...

تجميع البروتين يتسبب الأكسدة الخلوية. ويصف هذا البروتوكول وسيلة لرصد الدول داخل الخلايا من البروتينات أميلويدوجينيك والأكسدة المرتبطة بها، باستخدام التدفق الخلوي. يتم استخدام النهج لدراسة سلوك المتغيرات القابلة للذوبان والمعرضة للتجميع من الببتيد اميلويد بيتا.

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد العلاقة بين تكوين مجاميع البروتين داخل الخلايا وتأثيرها على الإجهاد التأكسدي الخلوي باستخدام خميرة الخباز خميرة الخميرة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أمراض البروتين الخاطئ والتراكم ، مثل الاضطرابات التنكسية العصبية والأميلويدوز غير الاعتلال العصبي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها بسيطة وسريعة وتسمح بقياس ضرر الإجهاد التأكسدي الخلوي في مجموعة كبيرة من الخميرة.باستخدام هذه الطريقة ، يمكننا تقديم نظرة ثاقبة للعلاقة بين الحالة القابلة للذوبان داخل الخلايا أو المجمعة لبروتين الأميلويد مع مستويات الإجهاد التأكسدي في الخميرة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا تطبيقه على الكائنات الحية النموذجية الأخرى التي تعبر عن البروتينات المؤتلفة. ستظهر تحليل قياس التدفق الخلوي مانويلا كوستا ، وهي فنية من مرفق قياس التدفق الخلوي في UAB.في هذه الدراسة ، يتم تتبع حالة التجميع داخل الخلايا لمتغيرات الببتيد المختلفة A-beta-42 باستخدام S.cerevisiae المحول مع ترميز البلازميد ل A-beta-42 المنصهر في GFP تحت سيطرة مروج محفز للجالاكتوز. اختر مستعمرة واحدة من خلايا الخميرة المحولة ، وقم بتلقيحها في 20 مل من وسط SC ناقص Ura الذي يحتوي على 2٪ جلوكوز. قم بزراعة الثقافة عند 30 درجة مئوية تحت التحريض بين عشية وضحاها.في اليوم التالي ، قم بتلقيح 100 ميكرولتر من المزرعة الليلية في خمسة ملليلتر من SC الطازج ناقص وسط Ura ، وقم بزراعة الخلايا عند 30 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات. عندما تكون الثقافة بكثافة بصرية عند 590 نانومتر أو OD 590 من 0.5 ، قم بالطرد المركزي للثقافة عند 3 ، 000 مرة جم لمدة أربع دقائق ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من SC الطازج ناقص وسط Ura الذي يحتوي على 2٪ رافينوز. احتضان الخلايا عند 30 درجة مئوية تحت التحريض لمدة 30 دقيقة.بعد 30 دقيقة ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 3 ، 000 مرة جم لمدة أربع دقائق ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في وسط SC جديد ناقص Ura يحتوي على 2٪ galactose للحث على التعبير عن البروتين المؤتلف. أعد الخلايا إلى الحاضنة لمدة 16 ساعة. بعد 16 ساعة ، قم بحصاد الخلايا عن طريق نقل كميات ملليلتر واحد من المزرعة إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المعقمة والطرد المركزي عند 3 ، 000 مرة جم لمدة أربع دقائق.ابدأ هذا الإجراء بتحديد OD 590 لخلايا الخميرة المستحثة لمدة 16 ساعة. ثم قم بتخفيف الخلايا في PBS المعقم إلى OD 590 من 0.1. انقل معلقات الخلايا الشفغة إلى أنابيب البوليسترين المستديرة ذات القاع الدائري المسمى بشكل مناسب ، وقم بحمايتها من الضوء.تحضير الخلايا غير المستحثة كعنصر تحكم سلبي لتحليل قياس التدفق الخلوي. أضف مسبار الإجهاد التأكسدي إلى كل عينة بتركيز نهائي يبلغ خمسة ميكرومولار. غطي العينات بورق الألمنيوم ، واحتضانها عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.عند الانتهاء من الحضانة ، قم بتدوير الخلايا ، وإزالة المادة الطافية ، وإعادة تعليق كريات الخلية في PBS. اغسل الخلايا ثلاث مرات بهذه الطريقة باستخدام PBS. بعد الغسيل الثالث ، أعد تعليق الخلايا بنفس حجم PBS.تأكد من تضمين الخلايا غير الملطخة في تحليل قياس التدفق الخلوي. باستخدام الليزر والمرشحات المناسبة ، قم بإجراء تحليل قياس التدفق الخلوي للكشف عن GFP وإشارة الفلورسنت لمسبار الإجهاد التأكسدي. ابدأ بالنقر فوق لوحة فتح ورقة عمل جديدة ، وقم بتسمية التجربة.من شريط الأدوات، حدد أداة مخطط التبعثر، وقم بإنشاء مخطط باستخدام المتغيرات منطقة التشتت الجانبية على المحور y مقابل منطقة التشتت الأمامية في مقياس خطي على المحور x. انقر فوق أداة مخطط مبعثر ، وقم بإنشاء مخطط باستخدام المتغيرات منطقة FITC على المحور x مقابل منطقة APC في مقياس لوغاريتمي على المحور y. انقر فوق أيقونة إعداد الأداة ، واضبط جميع مستويات التعويض على صفر في علامة التبويب التعويض.ثم انقر فوق علامة التبويب اكتساب ، وحدد العدد الإجمالي البالغ 20,000 حدث ليتم تسجيله بمعدل تدفق منخفض. نظرا لأنه يمكن اكتشاف إشارة انبعاث الفلورسنت لأحد الفلوروكروم بواسطة كاشف آخر ، فمن المهم إجراء عملية تعويض لمعادلة الإشارة الدقيقة لكل فلوروكروم في جميع أجهزة الكشف عن طريق تحكم أحادي اللون. أعد تسمية الأنبوب 001 كعنصر تحكم سلبي ، وانقر فوق علامة التبويب اكتساب لبدء تشغيل الخلايا غير المستحثة وغير الملطخة.اضبط الجهد في إعدادات الأداة للمبعثر الأمامي والجانبي حتى يتم توزيع السكان في الربع الأيسر الأوسط. انقر فوق رمز المضلع لتعيين منطقة R1 حول مجموعة الخلايا باستثناء بقايا الخلية ، واستخدم هذه المجموعة المسورة P1 تساوي R1 لجميع مخططات النقاط الفلورية وتمثيلات الرسم البياني. لضبط جهد PMT لإشارة التألق ، قم بتشغيل الخلايا غير الملوثة في مخطط النقاط FL1 إلى FL3 ، وضبط الكسب في علامة التبويب إعداد الأداة ، حتى يتم توزيع الخلايا في الربع الأيسر السفلي.باستخدام أداة مخطط التبعثر ، قم بإنشاء مخطط نقطي مع المتغيرات FITC-A في المحور x مقابل FSC-A ومخطط نقطة ثانية مع المتغيرات APC-A في المحور x مقابل FSC-A. بعد ذلك ، قم بتغيير العينة إلى الخلايا المستحثة لقياس تألق GFP. في علامة التبويب إعداد الأداة، قم بتعيين الكسب في FSC-A مقابل FITC عندما يتم توزيع السكان في الربع الأيمن الأدنى.حدد مجموعة الخلايا الإيجابية ل GFP باستخدام بوابة. قم بتغيير العينة إلى الخلايا الملطخة غير المستحثة. اعرض الإجهاد التأكسدي بواسطة التألق على مخطط نقطي FSC-A مقابل APC-A.قم بضبط الكسب حتى يتم توزيع مجموعة الخلايا في الربع العلوي الأيسر. بوابة عدد الخلايا الموجبة في P3. باستخدام رمز الرسم البياني ، قم بعمل مخططين للرسم البياني لتمثيل مضان الخلية ، أحدهما ل FITC والآخر لمضان APC. قم بإنشاء جدول يعرض متوسط شدة الفلورسنت ومتوسط التألق مع الخطأ المعياري المقابل و / أو معامل التباين لمستويات مضان GFP والإجهاد التأكسدي.انقر فوق علامة التبويب التعويض، وقم بتعيين جميع مستويات التعويض إلى الصفر. انقر فوق علامة التبويب اكتساب، وحدد العدد الإجمالي البالغ 20,000 حدث ليتم تسجيلها. قم بإعداد ثلاثة أنابيب جديدة من العينات ، وقم بتسميتها غير المستحثة ، والقابلة للذوبان المستحثة ، والمجمعة المستحثة.احصل على البيانات من العينات باستخدام الإعدادات المحددة مسبقا. قم بتحليل البيانات عن طريق فتح ورقة جديدة وإنشاء مخطط نقطي للمتغيرات FITC-A و APC-A ، وبوابة الخلايا الموجبة لتلوين CellROX. لكل عينة، قم بإنشاء جدول إحصائيات بمتوسط التألق والخطأ المعياري لقنوات FITC وAPC.من الممكن أيضا فرز الخلايا باستخدام فارز FACS بعد عد البروتين المجمع. يتم تصور خلايا الخميرة التي تعبر عن متغيرات A-beta-42 بعد فترة تحريض مدتها 16 ساعة تحت المجهر الفلوري لتحديد توزيع البروتين المؤتلف داخل الخلايا. تمثل هذه الصور متغيرات A-beta-42 GFP المختارة.تم تأكيد تكوين شوائب البروتين ، أو PI ، في 10 من أصل 20 متغيرا من المجموعة التي تم تحليلها. يشير هذا الرسم البياني الشريطي إلى النسبة المئوية للخلايا التي تحتوي على أعداد مختلفة من PI محسوبة من إجمالي 500 خلية فلورية لكل متغير إلى مكررات بيولوجية. لوحظ اتفاق ممتاز بين خصائص التجميع المتوقعة وفي الجسم الحي.تم قياس مستويات التعبير عن البروتين في المستخلصات الخلوية باستخدام جسم مضاد خاص ب A-beta. كاتجاه عام ، توجد متغيرات A-beta-42 المكونة ل PI ، الملونة باللون الأخضر ، بمستويات أقل من تلك الموزعة بشكل منتشر في العصارة الخلوية ، ملونة باللون الأحمر. لوحظت اختلافات مهمة بين متغيرات A-beta-42 عندما تم تمثيل تألق مسبار الإجهاد التأكسدي ومستويات البروتين وخصائص مضان GFP بالنسبة لقدرتها على تكوين PI وميولها الجوهرية للتجميع التي تنبأت بها خوارزمية المعلوماتية الحيوية AGGRESCAN أو TANGO.المتغيرات المكونة ل PI باللون الأخضر ، والمتغيرات غير المكونة ل PI باللون الأحمر. باتباع هذا الإجراء ، يمكن أيضا إجراء طرق أخرى مثل يوديد البروبيديوم أو تلطيخ الملحق V للإجابة على أسئلة إضافية مثل تحديد تأثير متغير البروتين المعبر عنه داخل الخلايا على موت الخلايا المبرمج للخلايا أو السمية الخلوية.

evaluation-impact-protein-aggregation-on-cellular-oxidative-stress

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

في هذا البروتوكول التعبير الجيني ، في الخميرة...

تحليل لميكروأري السكيراء الجعوية</em

هذه المخطوطة تصف ثلاثة بروتوكولات مكملة لتقييم سمية polyglutamine (polyQ) التوسع البروتينات في...

نمو فحوصات لتقييم السمية في الخميرة Polyglutamine

الجدوى الخلوية تعتمد على إدارة الوقت المناسب والفعال للmisfolding البروتين. نحن هنا وصف طريقة لتصور مصائر مختلفة المحتملة للبروتين تتجمع: طوي ثانية، وتدهور، أو عزل في الادراج. نحن لشرح استخدام جهاز استشعار للطي،...

4D التصوير التجميع البروتين في الخلايا الحية

توضح هذه المقالة استخدام luciferase يراعة-GFP انصهار بروتين...

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

تصف هذه المقالة مقايسة قائمة على نمو الخميرة لتحديد المتطلبات الجينية لتحلل البروتين. كما يوضح طريقة للاستخراج السريع لبروتينات الخميرة ، وهي مناسبة للنشاف الغربي لتأكيد متطلبات التحلل كيميائيا حيويا. يمكن تكييف هذه التقنيات لمراقبة تدهور مجموعة متنوعة من البروتينات.

تحديد القائم على النمو وتأكيد البيوكيميائية من متطلبات الوراثية للتدهور البروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

تعكس وفرة البروتين معدلات كل من تخليق البروتين وتدهور البروتين. تصف هذه المقالة استخدام مطاردة cycloheximide متبوعة بالنشاف الغربي لتحليل تحلل البروتين في نموذج حقيقيات النوى أحادية الخلية ، Saccharomyces cerevisiae (الخميرة الناشئة).

سيكلوهيكسيميد تحليل تشيس من تدهور البروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

وهدف الطريقة المعروضة هنا استكشاف تجميع البروتين أثناء الشيخوخة العادية في نموذج الكائن الحي C. ايليجانس. ويمثل البروتوكول أداة قوية لدراسة مجاميع كبيرة غير قابلة للذوبان العالية التي تشكل مع التقدم في السن وتحديد كيفية تأثير التغيرات في بروتيوستاسيس تجميع البروتين.

أساليب "دراسة التغيرات" في "تجميع البروتين الأصيل" مع التقدم في السن في ايليجانس كاينورهابديتيس

واحد من شروط الضغط الأكثر تحديا التي تواجهها الكائنات الحية خلال حياتهم ينطوي على التراكم للتأكسد. خلال الأكسدة، خلايا تعتمد بشدة على مرافقين الجزيئية. نقدم هنا، الأساليب المستخدمة في التحقيق ينظم الأكسدة التجميع المضادة النشاط، وكذلك فيما يتعلق برصد التغيرات الهيكلية التي تنظم وظيفة وصي باستخدام HDX--مرض التصلب العصبي المتعدد.

تعريف النشاط وصي ينظم الأكسدة والاختزال في Hsp33 وتعيين التغييرات كونفورماشونال في Hsp33 باستخدام الهيدروجين الديوتريوم التبادل الكتلي

يصف هذا البروتوكول استخراج وتصور البروتينات المجمعة والذوبانة من الإشريكية القولونية بعد العلاج بمضادات الميكروبات البروتوتوكسية. بعد هذا الإجراء يسمح مقارنة نوعية من البروتين تشكيل الكلي في الجسم الحي في سلالات بكتيرية مختلفة و / أو بين العلاجات.

استخراج وتصور مجاميع البروتين بعد علاج الإشريكية القولونية مع الإجهاد البروتيوكسي

مطلوب نموذج فسيولوجي في الجسم الحي من α-synuclein لدراسة وفهم التسبب في مرض باركنسون. وصفنا طريقة لمراقبة السمية الخلوية والتكوين الكلي ل α-synuclein باستخدام نموذج الخميرة المتوافق مع البشر.

طريقة لدراسة سمية α-سينوكلين وتجميعها باستخدام نموذج خميرة متوافق مع البشر

اكتشف تقييم تأثير تراكم البروتين على الإجهاد التأكسدي الخلوي باستخدام الخميرة Saccharomyces cerevisiae. تُستخدم تقنية التدفق الخلوي لتحليل حالات البروتينات القابلة للتكتل وعلاقتها بالأكسدة.

تقييم أثر تراكم البروتين في الأكسدة الخلوية في الخميرة

استكشف المزيد من الفيديوهات