تقييم أثر تراكم البروتين في الأكسدة الخلوية في الخميرة

تجميع البروتين يتسبب الأكسدة الخلوية. ويصف هذا البروتوكول وسيلة لرصد الدول داخل الخلايا من البروتينات أميلويدوجينيك والأكسدة المرتبطة بها، باستخدام التدفق الخلوي. يتم استخدام النهج لدراسة سلوك المتغيرات القابلة للذوبان والمعرضة للتجميع من الببتيد اميلويد بيتا.

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد العلاقة بين تكوين مجاميع البروتين داخل الخلايا وتأثيرها على الإجهاد التأكسدي الخلوي باستخدام خميرة الخباز خميرة الخميرة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أمراض البروتين الخاطئ والتراكم ، مثل الاضطرابات التنكسية العصبية والأميلويدوز غير الاعتلال العصبي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها بسيطة وسريعة وتسمح بقياس ضرر الإجهاد التأكسدي الخلوي في مجموعة كبيرة من الخميرة.

باستخدام هذه الطريقة ، يمكننا تقديم نظرة ثاقبة للعلاقة بين الحالة القابلة للذوبان داخل الخلايا أو المجمعة لبروتين الأميلويد مع مستويات الإجهاد التأكسدي في الخميرة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا تطبيقه على الكائنات الحية النموذجية الأخرى التي تعبر عن البروتينات المؤتلفة. ستظهر تحليل قياس التدفق الخلوي مانويلا كوستا ، وهي فنية من مرفق قياس التدفق الخلوي في UAB.

في هذه الدراسة ، يتم تتبع حالة التجميع داخل الخلايا لمتغيرات الببتيد المختلفة A-beta-42 باستخدام S.cerevisiae المحول مع ترميز البلازميد ل A-beta-42 المنصهر في GFP تحت سيطرة مروج محفز للجالاكتوز. اختر مستعمرة واحدة من خلايا الخميرة المحولة ، وقم بتلقيحها في 20 مل من وسط SC ناقص Ura الذي يحتوي على 2٪ جلوكوز. قم بزراعة الثقافة عند 30 درجة مئوية تحت التحريض بين عشية وضحاها.

في اليوم التالي ، قم بتلقيح 100 ميكرولتر من المزرعة الليلية في خمسة ملليلتر من SC الطازج ناقص وسط Ura ، وقم بزراعة الخلايا عند 30 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات. عندما تكون الثقافة بكثافة بصرية عند 590 نانومتر أو OD 590 من 0.5 ، قم بالطرد المركزي للثقافة عند 3 ، 000 مرة جم لمدة أربع دقائق ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من SC الطازج ناقص وسط Ura الذي يحتوي على 2٪ رافينوز. احتضان الخلايا عند 30 درجة مئوية تحت التحريض لمدة 30 دقيقة.

بعد 30 دقيقة ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 3 ، 000 مرة جم لمدة أربع دقائق ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في وسط SC جديد ناقص Ura يحتوي على 2٪ galactose للحث على التعبير عن البروتين المؤتلف. أعد الخلايا إلى الحاضنة لمدة 16 ساعة. بعد 16 ساعة ، قم بحصاد الخلايا عن طريق نقل كميات ملليلتر واحد من المزرعة إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المعقمة والطرد المركزي عند 3 ، 000 مرة جم لمدة أربع دقائق.

ابدأ هذا الإجراء بتحديد OD 590 لخلايا الخميرة المستحثة لمدة 16 ساعة. ثم قم بتخفيف الخلايا في PBS المعقم إلى OD 590 من 0.1. انقل معلقات الخلايا الشفغة إلى أنابيب البوليسترين المستديرة ذات القاع الدائري المسمى بشكل مناسب ، وقم بحمايتها من الضوء.

تحضير الخلايا غير المستحثة كعنصر تحكم سلبي لتحليل قياس التدفق الخلوي. أضف مسبار الإجهاد التأكسدي إلى كل عينة بتركيز نهائي يبلغ خمسة ميكرومولار. غطي العينات بورق الألمنيوم ، واحتضانها عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

عند الانتهاء من الحضانة ، قم بتدوير الخلايا ، وإزالة المادة الطافية ، وإعادة تعليق كريات الخلية في PBS. اغسل الخلايا ثلاث مرات بهذه الطريقة باستخدام PBS. بعد الغسيل الثالث ، أعد تعليق الخلايا بنفس حجم PBS.

تأكد من تضمين الخلايا غير الملطخة في تحليل قياس التدفق الخلوي. باستخدام الليزر والمرشحات المناسبة ، قم بإجراء تحليل قياس التدفق الخلوي للكشف عن GFP وإشارة الفلورسنت لمسبار الإجهاد التأكسدي. ابدأ بالنقر فوق لوحة فتح ورقة عمل جديدة ، وقم بتسمية التجربة.

من شريط الأدوات، حدد أداة مخطط التبعثر، وقم بإنشاء مخطط باستخدام المتغيرات منطقة التشتت الجانبية على المحور y مقابل منطقة التشتت الأمامية في مقياس خطي على المحور x. انقر فوق أداة مخطط مبعثر ، وقم بإنشاء مخطط باستخدام المتغيرات منطقة FITC على المحور x مقابل منطقة APC في مقياس لوغاريتمي على المحور y. انقر فوق أيقونة إعداد الأداة ، واضبط جميع مستويات التعويض على صفر في علامة التبويب التعويض.

ثم انقر فوق علامة التبويب اكتساب ، وحدد العدد الإجمالي البالغ 20,000 حدث ليتم تسجيله بمعدل تدفق منخفض. نظرا لأنه يمكن اكتشاف إشارة انبعاث الفلورسنت لأحد الفلوروكروم بواسطة كاشف آخر ، فمن المهم إجراء عملية تعويض لمعادلة الإشارة الدقيقة لكل فلوروكروم في جميع أجهزة الكشف عن طريق تحكم أحادي اللون. أعد تسمية الأنبوب 001 كعنصر تحكم سلبي ، وانقر فوق علامة التبويب اكتساب لبدء تشغيل الخلايا غير المستحثة وغير الملطخة.

اضبط الجهد في إعدادات الأداة للمبعثر الأمامي والجانبي حتى يتم توزيع السكان في الربع الأيسر الأوسط. انقر فوق رمز المضلع لتعيين منطقة R1 حول مجموعة الخلايا باستثناء بقايا الخلية ، واستخدم هذه المجموعة المسورة P1 تساوي R1 لجميع مخططات النقاط الفلورية وتمثيلات الرسم البياني. لضبط جهد PMT لإشارة التألق ، قم بتشغيل الخلايا غير الملوثة في مخطط النقاط FL1 إلى FL3 ، وضبط الكسب في علامة التبويب إعداد الأداة ، حتى يتم توزيع الخلايا في الربع الأيسر السفلي.

باستخدام أداة مخطط التبعثر ، قم بإنشاء مخطط نقطي مع المتغيرات FITC-A في المحور x مقابل FSC-A ومخطط نقطة ثانية مع المتغيرات APC-A في المحور x مقابل FSC-A. بعد ذلك ، قم بتغيير العينة إلى الخلايا المستحثة لقياس تألق GFP. في علامة التبويب إعداد الأداة، قم بتعيين الكسب في FSC-A مقابل FITC عندما يتم توزيع السكان في الربع الأيمن الأدنى.

حدد مجموعة الخلايا الإيجابية ل GFP باستخدام بوابة. قم بتغيير العينة إلى الخلايا الملطخة غير المستحثة. اعرض الإجهاد التأكسدي بواسطة التألق على مخطط نقطي FSC-A مقابل APC-A.

قم بضبط الكسب حتى يتم توزيع مجموعة الخلايا في الربع العلوي الأيسر. بوابة عدد الخلايا الموجبة في P3. باستخدام رمز الرسم البياني ، قم بعمل مخططين للرسم البياني لتمثيل مضان الخلية ، أحدهما ل FITC والآخر لمضان APC. قم بإنشاء جدول يعرض متوسط شدة الفلورسنت ومتوسط التألق مع الخطأ المعياري المقابل و / أو معامل التباين لمستويات مضان GFP والإجهاد التأكسدي.

انقر فوق علامة التبويب التعويض، وقم بتعيين جميع مستويات التعويض إلى الصفر. انقر فوق علامة التبويب اكتساب، وحدد العدد الإجمالي البالغ 20,000 حدث ليتم تسجيلها. قم بإعداد ثلاثة أنابيب جديدة من العينات ، وقم بتسميتها غير المستحثة ، والقابلة للذوبان المستحثة ، والمجمعة المستحثة.

احصل على البيانات من العينات باستخدام الإعدادات المحددة مسبقا. قم بتحليل البيانات عن طريق فتح ورقة جديدة وإنشاء مخطط نقطي للمتغيرات FITC-A و APC-A ، وبوابة الخلايا الموجبة لتلوين CellROX. لكل عينة، قم بإنشاء جدول إحصائيات بمتوسط التألق والخطأ المعياري لقنوات FITC وAPC.

من الممكن أيضا فرز الخلايا باستخدام فارز FACS بعد عد البروتين المجمع. يتم تصور خلايا الخميرة التي تعبر عن متغيرات A-beta-42 بعد فترة تحريض مدتها 16 ساعة تحت المجهر الفلوري لتحديد توزيع البروتين المؤتلف داخل الخلايا. تمثل هذه الصور متغيرات A-beta-42 GFP المختارة.

تم تأكيد تكوين شوائب البروتين ، أو PI ، في 10 من أصل 20 متغيرا من المجموعة التي تم تحليلها. يشير هذا الرسم البياني الشريطي إلى النسبة المئوية للخلايا التي تحتوي على أعداد مختلفة من PI محسوبة من إجمالي 500 خلية فلورية لكل متغير إلى مكررات بيولوجية. لوحظ اتفاق ممتاز بين خصائص التجميع المتوقعة وفي الجسم الحي.

تم قياس مستويات التعبير عن البروتين في المستخلصات الخلوية باستخدام جسم مضاد خاص ب A-beta. كاتجاه عام ، توجد متغيرات A-beta-42 المكونة ل PI ، الملونة باللون الأخضر ، بمستويات أقل من تلك الموزعة بشكل منتشر في العصارة الخلوية ، ملونة باللون الأحمر. لوحظت اختلافات مهمة بين متغيرات A-beta-42 عندما تم تمثيل تألق مسبار الإجهاد التأكسدي ومستويات البروتين وخصائص مضان GFP بالنسبة لقدرتها على تكوين PI وميولها الجوهرية للتجميع التي تنبأت بها خوارزمية المعلوماتية الحيوية AGGRESCAN أو TANGO.

المتغيرات المكونة ل PI باللون الأخضر ، والمتغيرات غير المكونة ل PI باللون الأحمر. باتباع هذا الإجراء ، يمكن أيضا إجراء طرق أخرى مثل يوديد البروبيديوم أو تلطيخ الملحق V للإجابة على أسئلة إضافية مثل تحديد تأثير متغير البروتين المعبر عنه داخل الخلايا على موت الخلايا المبرمج للخلايا أو السمية الخلوية.