تحليل لميكروأري السكيراء الجعوية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تعريف طلاب العلوم الجامعيين بتقنية المصفوفات الدقيقة من خلال فحص اختلافات التعبير في الخميرة التي تتعرض للإجهاد التأكسدي. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل الحمض النووي الريبي الكلي أولا عن مزارع الخميرة المعالجة ببيروكسيد الهيدروجين والضوابط غير المعالجة. تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في إنشاء وتنقية CDNA من عينات الحمض النووي الريبي هذه.

ثم يتم استخدام CDNA لإعداد البيوتين المسمى CRNA عن طريق النسخ في المختبر. الخطوة الأخيرة من الإجراء هي تجزئة CRNAs المسماة بالبيوتين للتهجين إلى رقائق جينات الخميرة لمقاييس AFI. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر اختلافات التعبير في عينتي الخميرة ومن خلال المعلوماتية الحيوية توضح قوة تحليل المصفوفات الدقيقة للطلاب الجامعيين.

كان لدى فريق Vermont Genetics Network Outreach فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما تم تكليفهم بتقديم تقنية الأشعة الدقيقة لطلاب العلوم في جميع أنحاء ولاية فيرمونت من أجل تعزيز تعليمهم العلمي. حتى الآن ، تم تسليم هذه الطريقة إلى مواقع متعددة في ثماني كليات للبكالوريا في جميع أنحاء الولاية. لذا فإن الميزة الرئيسية لاستخدام الأشعة الدقيقة في وحدات التدريس ، فهي تمنحنا القدرة على تعليم تقنيات البيولوجيا الجزيئية العامة التي تستخدم كل يوم في جميع أنحاء المختبر لمجموعة من الأفراد.

ويمكننا أيضا استخدام هذا لتعليم الطلاب والمعلمين على حد سواء ومجموعاتنا. لدينا بالفعل طلاب وأساتذة يعملون معا في نفس المشروع. يتعلمون تقنيات معينة تتطلب الكثير من البراعة ، مثل التعامل مع الحمض النووي الريبي ، وهي ليست مهمة سهلة.

يتعلمون كيفية ترسيب الحمض النووي باستخدام كواشف التصور. إنهم في الواقع يستخدمون التقنيات التي سيواجهونها في الدراسات العليا أو في مختبرات البيولوجيا الجزيئية اليومية. على الرغم من أن هذه الطريقة مناسبة لاكتساب نظرة ثاقبة في الإجهاد التأكسدي والخميرة ، إلا أنها تنطبق بالتأكيد على الكائنات الحية النموذجية الأخرى والأنظمة البيولوجية الأخرى التي قد ترغب في النظر إليها.

يتغير التعبير الجيني سواء كان مرتبطا بالتغيرات التنموية ، والسموم البيئية ، وحالات مرضية معينة ، وغير ذلك الكثير. لفحص اختلافات التعبير في الخميرة التي تتعرض للإجهاد التأكسدي ، يتم استخراج الحمض النووي الريبي الكلي أولا من مزرعتين من مزرعتي الخميرة عن طريق التحلل الأنزيمي. تعرضت إحدى المزرعات للإجهاد التأكسدي من خلال معالجة لمدة ساعة واحدة ببيروكسيد الهيدروجين 0.5 ملليمولار في محلول ملحي مخزن في هانك بينما عولجت المزرعة الأخرى باستخدام HBSS فقط كعنصر تحكم.

ابدأ بوضع ملصقات على أنبوبين من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.7 مليلتر بمعلومات التعريف المناسبة. انقل 1.5 مل من ثقافة الخميرة المناسبة إلى كل أنبوب. الطرد المركزي الأنابيب عند 5 ، 000 Gs لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.

بعد الطرد المركزي ، استخدم ماصة صغيرة لإزالة المادة الطافية والتخلص منها بعناية دون إزعاج الحبيبات. تأكد من أن الحبيبات كبيرة بما يكفي قبل متابعة الإجراء. إذا كانت الحبيبات صغيرة جدا, أضف 1.5 مل من الثقافة في نفس الأنبوب الذي يحتوي على الحبيبات ثم جهاز الطرد المركزي للحصول على حبيبات أكبر.

تخلص من المادة الطافية بماصة صغيرة ، وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من السائل من حبيبات الخميرة. ثم أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت SG و 30 ميكرولتر من محلول الربط إلى دوامة حبيبات الخميرة للخلط. احتضان كلا الأنبوبين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أثناء الحضانة.

بتدوير كل أنبوب برفق كل 10 دقائق لتوليد لوحات. تتمثل إحدى أهم الخطوات عند قيامك بطلاء الخميرة بالكرو في التأكد من أنك قمت بالفعل بإنشاء مائة بالمائة من Sphero plast بعد العلاج. هذا يعني أنه ليس كل الإنزيم المحلل متساويا.

لذلك عليك التحقق للتأكد من أن الإنزيم المحلل الجيد يمنحك طلاءا كرويا جيدا ، مما يعني أنه يجب عليك أخذ هذه العينات ووضعها على شريحة مجهرية والتحقق منها تحت المجهر عن طريق إضافة 0.1٪ SDS للتأكد من أن لديك تكوين البروتوبلاست. لمراقبة الطلاء الكروي الكامل ، ضع ماصة 10 ميكرولترات من عينة الخميرة على شريحة مجهرية أثناء فحص العينة تحت المجهر عند ميكرولتر واحد من 0.1٪ SDS للتسبب في انتفاخ خلايا الخميرة وتشكيل كرات أو كرويات مثالية. من المهم ملاحظة أن الخلايا الناشئة تشكل كرويات S أيضا.

إذا لوحظ طلاء كروي جزئي ، يوصى بعلاج ممتد بالاتصال. بمجرد تأكيد الطلاء الكروي الكامل عند 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت BRLT لكل أنبوب ، أضف 250 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪. تأكد من تغطية الأنبوب بإحكام عن طريق إغلاق الغطاء والدوامة بقوة لمدة دقيقة واحدة.

سيؤدي هذا الإجراء إلى قمل لوحات Sphero. بعد ذلك ، استخدم أعمدة الدوران R و Z سهلة لجمع وتنظيف الحمض النووي الريبي من الثقافتين. أخيرا ، قم بتقييم جودة الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام 1.2٪ جل أروس مسبقة الصب للرحلان الكهربائي لتحضير البيوتين المسمى CRNA.

يتم استخدام إجمالي الحمض النووي الريبي المستخرج من خلايا الخميرة أولا لتصنيع CD NA عن طريق النسخ العكسي. بعد توليد CD NA ، قم بإعداد أنابيب هلام قفل الطور للاستخدام في أنابيب هلام قفل الطور لأجهزة الطرد المركزي CD NA بأقصى سرعة لمدة دقيقة واحدة لضمان وجود الجل في الجزء السفلي من الأنبوب. لا تقم بتدوير أنابيب قفل الطور الدوامة لترسيب ماصة CD NA 162 ميكرولتر من الطبقة السفلية من خلط كلوروفورم فينيل مخزن بدرجة الحموضة 8.0 تريس أو كحول الأيزواميل أو خليط PCI وإضافة إلى محتويات 162 ميكرولتر من الخيط الثاني ، يلزم وجود أحجام متساوية من المخاليط المائية والعضوية لهذه الخطوة.

دوامة لمدة خمس ثوان لخلط المحتويات. بعد ذلك، استخدم ماصة صغيرة لنقل كل خليط CD N-A-P-C-I إلى أنبوب هلام قفل الطور. لا تقم بتدوير جهاز الطرد المركزي لأنبوب هلام قفل الطور بأقصى سرعة لمدة دقيقتين.

ثم استخدم ماصة صغيرة لنقل الطبقة العليا من أنبوب هلام قفل الطور إلى أنبوب سعة 1.7 مليلتر مسمى حديثا. حاول جمع أكبر قدر ممكن من الطبقة. أضف ما يلي إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير سعة 1.7 ملليلتر ، و 405 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ ، و 80 ميكرولتر من أسيتات الأمونيوم ، وميكرولتر واحد من دوامة طلاء الحبيبات.

ضع الأنبوب لفترة وجيزة في جهاز الطرد المركزي بحيث تكون مفصلة الأنبوب متجهة للخارج وجهاز الطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة 20 دقيقة. في درجة حرارة الغرفة عند اكتمال الطرد المركزي ، قم بإزالة الأنبوب برفق من جهاز الطرد المركزي مع الحرص على عدم إزعاج حبيبات CD NA. يجب أن تكون الحبيبات وردية بسبب طلاء الحبيبات وحجم حبة الملح تقريبا.

وعلى جانب الأنبوب الموجود أسفل المفصلة ، ضع حبيبات CD NA على الجليد وانتقل على الفور إلى تنظيف الحبيبات. لبدء إجراء تنظيف حبيبات CD NA ، استخدم ماصة صغيرة P 1000 لإزالة كل المادة الطافية بعناية من الأنبوب. احرص على عدم إزعاج الحبيبات.

إنها عينتك في 500 ميكرولتر من البرد ، 80٪ من الإيثانول في الأنبوب. قم بتغطية الأنبوب برفق واقلبه ببطء عدة مرات. راقب الحبيبات عن كثب للتأكد من أنها لا تنفصل عن جانب الأنبوب.

إذا انفصلت الحبيبات ، فيمكنك إعادتها إلى قاع الأنبوب إما عن طريق وضع الأنبوب مرة أخرى في الرف وترك الحبيبات تستقر في الأسفل أو الطرد المركزي للأنبوب بأقصى سرعة لمدة 15 ثانية. بعد ذلك ، استخدم ماصة صغيرة P 1000 لإزالة الإيثانول بعناية دون إزعاج الحبيبات. قم بإمالة الأنبوب لتمكين إزالة أكبر قدر ممكن من السائل.

أضف Eloqua جديدا من البارد ، 80٪ من الإيثانول ، وقم بتغطية الأنبوب واقلبه ببطء عدة مرات. بعد إزالة كل الإيثانول الممكن باستخدام ماصة صغيرة P 1000. الطرد المركزي الأنبوب بأقصى سرعة لمدة خمس ثوان.

ثم استخدم ماصة صغيرة P 10 لإزالة آخر بضعة ميكرولترات من الإيثانول دون إزعاج الحبيبات. ضع الأنبوب المفتوح في صندوق تجفيف لمدة 10 إلى 20 دقيقة لتبخر الإيثانول المتبقي. تفقد الحبيبات بسهولة بمجرد أن تجف ، لذا احرص على التعامل مع الأنبوب برفق وإغلاق الغطاء.

عند الانتهاء من التجفيف, تخيل الحبيبات المجففة للتأكد من وجودها في الأنبوب. أخيرا ، أعد تعليق الحبيبات المجففة في 22 ميكرولتر من الماء الخالي من الحمض النووي الريبي وضع الأنبوب على الثلج. ثم يتم استخدام CDNA هذا لإعداد البيوتين المسمى CRNA عن طريق النسخ في المختبر باستخدام مجموعة Enzo BioArray.

بعد تنظيف البيوتين المسمى CRNA وقياسه كميا ، يتم تقسيمه لإعداد الهدف. بمجرد إنشاء CDNA ، نستخدم بعد ذلك منهجية النسخ القياسية في المختبر من أجل توليد CRNA البيوتينيل. يحتاج CRNA إلى المرور بالتجزئة قبل أن يتم تطبيقه على شريحة الأشعة الدقيقة.

لبدء هذا الإجراء ، قم بنقل كمية تعادل خمسة ميكروغرامات من CRNA إلى أنبوب PCR مسمى 0.5 ملليلتر. أضف كمية كافية من الماء الحر من الحمض النووي الريبي ليصل الحجم الإجمالي إلى 16 ميكرولترا ، ثم أضف أربعة ميكرولترات من خمسة × مخزن مؤقت للتجزئة إلى الأنبوب. يجب أن يكون الحجم الإجمالي في الأنبوب 20 ميكرولترا.

دوامة الأنبوب وجهاز الطرد المركزي لمدة 10 ثوان. ثم احتضان الأنبوب عند 94 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. في الدراجة الحرارية ، ضع الأنبوب على الجليد بعد الحضانة.

ثم يتم تقييم CRNA المجزأ وغير المجزأ من كل عينة عن طريق الرحلان الكهربائي باستخدام هلام AROS مسبقة الصب بنسبة 1.2٪. عند اكتمال التشغيل ، يتم تصور الجل على جهاز المصباح ويتم الحصول على صورة. يتم تهجين منتج التوليف النهائي إلى رقائق جين الخميرة المتريكية والنتائج التمثيلية من تحليل المصفوفات الدقيقة موضحة هنا.

هذا الشكل الأول هو مثال على صورة رقاقة جين خميرة أتريكس الممسوحة ضوئيا تم إنشاؤها بواسطة برنامج تشغيل رقاقة الجينات atrics. هذا هو مخطط مبعثر ثنائي الأبعاد لجميع النصوص الجينية ، حوالي 6،700 جين يقارن بيانات الخميرة الضابطة والمعالجة. تمثل كل نقطة جينا واحدا.

الجينات الملونة باللون الأرجواني إلى الجينات التي يتم التعبير عنها بشكل تفاضلي بينما الجينات الملونة باللون الأحمر ليست كذلك. في هذا المثال ، معظم الجينات المعبر عنها تفاضليا هي تلك التي تشارك في التحكم في دورة الخلية كما هو موضح في أوصافها. يوضح هذا المخطط الانسيابي من قاعدة البيانات لتصور التعليقات التوضيحية والاكتشاف المتكامل الجينات المعبر عنها تفاضليا في مسار بيولوجي متأثر.

تشير الجينات المشار إليها بنجمة حمراء إلى الجينات التي تم تنظيمها في المسار الانخسيالي. أخيرا ، يتم عرض النتائج التمثيلية لمؤامرة البركان التي تم إنشاؤها باستخدام برنامج غربال الجينات للأنواع الجغرافية هنا. تمت مقارنة العينات الضابطة والمعالجة مع قطع قيمة P بمقدار 0.05 وقطع تغيير التعبير 1.5 ضعف.

اخترنا استخدام الخميرة لأن الخميرة سهلة النمو بسرعة ، لكننا أدركنا أيضا أن الجزء الأكثر أهمية في العمل مع الخميرة هو في الواقع إنشاء طلاء كروي لائق. أحد الأشياء التي لا نريد القيام بها في المصفوفة الدقيقة هو القيام بعملية هضم غير كاملة وفي الواقع فقط خلايا البلاست الكروية الموجودة في مرحلة G واحد أو G اثنين M. وبعد ذلك تقوم بتجربة مصفوفة دقيقة على الخميرة التي هي في مرحلة النسخ المتماثل المعينة.

نقطة أخرى معقدة نحاول إحضارها إلى المنزل في هذا التمرين هي أن تكوير CD NA يتحدث عنه الناس كل يوم ، لكن ليس بالضرورة سهلا. وما فعلناه في وحدتنا هو أننا استخدمنا بالفعل أنابيب متخصصة وكواشف تصور. حتى نتمكن في الواقع من تدوير الحمض النووي ويمكنك تصور الاستئناف، مما يجعل الأمر أسهل على الطلاب والمعلمين على حد سواء.

لذلك يمكن استخدامه في جميع مراحل عمل الحمض النووي والحمض النووي الريبي بعد تطوره. لقد مهدت هذه الوحدة الطريق حقا لأعضاء هيئة التدريس في معاهد البكالوريا لاستكشاف الكائنات الحية النموذجية الأخرى أو أنظمة العلاج الأخرى التي قد تكون متوافقة مع المناهج الحالية أو ربما اهتماماتهم البحثية الخاصة. ولإعطائكم مثالا على بعض التعديلات التي تم إجراؤها ، كان هناك موقع واحد نظر في آثار العلاج بمبيدات الأعشاب على الخميرة أو آخر نظر في علاج LAMP IDE في الخميرة ، بينما نظر موقع آخر في التغيرات التنموية في خط خلايا الثدييات التي كانوا مهتمين بها بشكل خاص.

وأخيرا ، نظر موقع آخر في تأثير مصادر الضوء التفاضلية على الأرابيدوبسيس أو النباتات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد تجربة الأشعة الدقيقة مع طلاب العلوم الجامعيين ، بما في ذلك عزل الحمض النووي الريبي الكلي عن الخميرة ، وتوليد CDNA ، وتجزئة البيوتين المسمى CRNA. تساعد الخبرات العملية مع مثل هذه التقنيات عالية المستوى على تعزيز وتعزيز تعليم العلوم الجامعي.