تحليل لميكروأري السكيراء الجعوية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تعريف طلاب العلوم في المرحلة الجامعية بتقنية المصفوفات الدقيقة (microarray) من خلال فحص الفروق في التعبير الجيني في خميرة تتعرض للإجهاد التأكسدي. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل الحمض النووي الريبي الكلي (total RNA) من مستنبتات الخميرة المعالجة ببيروكسيد الهيدروجين والمجموعات الضابطة غير المعالجة. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في توليد وتنقية الحمض النووي الريبي المتمم (CDNA) من عينات الـ RNA هذه.

يُستخدم الـ CDNA بعد ذلك لتحضير cRNA مُوسوم بالبيوتين عبر عملية النسخ في المختبر. وتتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في تكسير الـ cRNAs المُوسومة بالبيوتين لتهيئتها للهجن مع شرائح جينات الخميرة من نوع AFI metrics. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج توضح الاختلافات في التعبير الجيني بين عينتي الخميرة، ومن خلال المعلوماتية الحيوية، يتم إثبات قوة تحليل المصفوفات الدقيقة لطلاب المرحلة الجامعية.

جاءت الفكرة الأولى لهذه الطريقة لفريق التوعية في شبكة فيرمونت للوراثة (Vermont Genetics Network Outreach) عندما كُلفوا بتوفير تقنية الميكروراي (microray) لطلاب العلوم في جميع أنحاء ولاية فيرمونت بهدف تعزيز تعليمهم العلمي. وحتى الآن، تم تطبيق هذه الطريقة في مواقع متعددة في ثماني كليات تمنح درجة البكالوريوس في جميع أنحاء الولاية. لذا فإن الميزة الرئيسية لاستخدام وحدات التدريس الخاصة بالميكروراي هي أنها تمنحنا القدرة على تعليم مجموعة من الأفراد تقنيات البيولوجيا الجزيئية العامة المستخدمة يومياً في المختبر.

كما نستفيد من ذلك في التدريس للطلاب والمعلمين على حد سواء ولمجموعاتنا؛ حيث يعمل الطلاب والأساتذة فعلياً معاً في المشروع ذاته. ومن خلال ذلك، يتعلمون تقنيات معينة تتطلب دقة عالية، مثل التعامل مع RNA، وهي ليست بالمهمة السهلة.

يتعلم الطلاب كيفية ترسيب DNA باستخدام كواشف التصوير. وبذلك، يتمكنون فعلياً من استخدام التقنيات التي سيواجهونها في الدراسات العليا أو في مختبرات البيولوجيا الجزيئية اليومية. ورغم أن هذه الطريقة مناسبة لاكتساب رؤى حول الإجهاد التأكسدي في الخميرة، إلا أنها قابلة للتطبيق بالتأكيد على كائنات نموذجية أخرى وأنظمة بيولوجية أخرى قد ترغب في دراستها.

تتغير التعبيرات الجينية سواء كانت مرتبطة بتغيرات نمائية، أو سموم بيئية، أو حالات مرضية محددة، وغيرها الكثير. ولفحص اختلافات التعبير في خميرة تتعرض للإجهاد التأكسدي، يتم أولاً استخلاص الـ RNA الكلي من مستنبتين من الخميرة عن طريق التحلل الإنزيمي. وقد عُرِّض أحد المستنبتين للإجهاد التأكسدي من خلال المعالجة لمدة ساعة واحدة بـ 0.5 millimolar من بيروكسيد الهيدروجين في محلول هانكس الملح المملح (HBSS)، بينما عولج المستنبت الآخر بـ HBSS فقط كمجموعة ضابطة.

ابدأ بتسمية أنبوبي طرد مركزي دقيق سعة 1.7 milliliter بمعلومات التعريف المناسبة. انقل 1.5 milliliters من مزرعة الخميرة المناسبة إلى كل أنبوب. قم بطرد الأنابيب مركزياً عند 5,000 Gs لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.

بعد عملية الطرد المركزي، استخدم ماصة دقيقة لإزالة السائل الطافي والتخلص منه بعناية دون تعكير الراسب. تحقق من أن حجم الراسب كافٍ قبل المتابعة في الإجراء. إذا كان الراسب صغيراً جداً، أضف 1.5 milliliters من المزرعة إلى نفس الأنبوب الذي يحتوي على الراسب، ثم قم بإجراء الطرد المركزي للحصول على راسب أكبر.

تخلص من السائل الطافي باستخدام ماصة دقيقة، مع إزالة أكبر قدر ممكن من السائل من كتلة الخميرة. ثم أضف 100 µL من منظم SG و30 µL من محلول الليز إلى كتلة الخميرة، ثم استخدم جهاز الرج المداري (vortex) للمزج. قم بحضن كلا الأنبوبين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة خلال فترة التحضين.

قم بتدوير كل أنبوب برفق كل 10 دقائق لتكوين الكرات. إن إحدى أهم الخطوات عند إجراء عملية طلاء الكرات لخميرة هي التأكد من أنك قد أنشأت بالفعل كرات بروتوبلاست بنسبة مائة بالمائة بعد المعالجة. وهذا يعني أن الإنزيمات الحالة ليست كلها متساوية في الفعالية.

لذلك، يجب التحقق من أن الإنزيم المحلل يعمل بكفاءة ويمنحك نتائج جيدة في تكوين الكريات، مما يعني ضرورة أخذ هذه العينات ووضعها على شريحة مجهرية وفحصها تحت المجهر مع إضافة 0.1%SDS للتأكد من تكوين البروتوبلاستات. ولملاحظة تكوين الكريات بشكل كامل، قم بسحب 10 µL من عينة الخميرة ووضعها على شريحة مجهرية أثناء فحص العينة تحت المجهر مع إضافة 1 µL من 0.1%SDS لتحفيز خلايا الخميرة على الانتفاخ وتكوين كرات أو كريات مثالية. ومن المهم ملاحظة أن الخلايا البرعمية تشكل كريات أيضاً.

إذا لوحظ ترسيب جزئي للكرات، فيوصى بتمديد فترة المعالجة بإنزيم liase. وبمجرد التأكد من الترسيب الكامل للكرات عند إضافة 350 microliters من منظم BRLT إلى كل أنبوب، يتم إضافة 250 microliters من ethanol بتركيز 100%. تأكد من إغلاق الأنبوب بإحكام عن طريق تثبيت الغطاء مغلقاً، ثم قم بالرج بقوة باستخدام جهاز vortex لمدة دقيقة واحدة.

سيتضمن هذا الإجراء تكسير كرات Sphero. بعد ذلك، استخدم أعمدة دوران R and easy Z لجمع وتنقية RNA من المزرعتين. وأخيراً، قم بتقييم جودة RNA المستخلص باستخدام هلام agarose مسبق الصب بتركيز 1.2% للرحلان الكهربائي لتحضير cRNA المسمى بالبيوتين.

يُستخدم إجمالي الـ RNA المستخلص من خلايا الخميرة أولاً لتخليق الـ cDNA عن طريق النسخ العكسي. بعد توليد الـ cDNA، قم بتجهيز أنابيب هلام phase lock لاستخدامها في ترسيب الـ cDNA؛ يتم طرد أنابيب هلام phase lock مركزياً بالسرعة القصوى لمدة دقيقة واحدة لضمان استقرار الهلام في قاع الأنبوب. لا تقم برج أنابيب phase lock باستخدام جهاز الـ vortex. لترسيب الـ cDNA، اسحب ماصة 162 microliters من الطبقة السفلية لمزيج tris buffered phenyl chloroform و isoamyl alcohol بـ pH 8.0 (أو مزيج PCI)، وأضفها إلى محتويات أنبوب تفاعل تخليق الشريط الثاني من الـ cDNA البالغة 162 microliter؛ حيث تتطلب هذه الخطوة أحجاماً متساوية من المزيجين المائي والعضوي.

استخدم جهاز الرج الدوامي (Vortex) لمدة خمس ثوانٍ لخلط المحتويات. بعد ذلك، استخدم ماصة دقيقة لنقل كامل خليط CD N-A-P-C-I إلى أنبوب هلام القفل الطوري (phase lock gel tube). لا تستخدم جهاز الرج الدوامي مع أنبوب هلام القفل الطوري، بل قم بالطرد المركزي بالسرعة القصوى لمدة دقيقتين.

بعد ذلك، استخدم ماصة دقيقة لنقل الطبقة العلوية من أنبوب هلام قفل الطور (phase lock gel) إلى أنبوب جديد سعة 1.7 milliliter يحمل ملصقاً تعريفياً. حاول جمع أكبر قدر ممكن من هذه الطبقة. أضف إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.7 milliliter ما يلي: 405 µL من 100%ethanol، و 80 µL من أسيتات الأمونيوم، و 1 µL من صبغة الراسب (pellet paint)، ثم قم بعملية المزج الدوامي (vortex).

ضع الأنبوب بإيجاز في جهاز الطرد المركزي بحيث يكون مفصل الأنبوب موجهاً للخارج، ثم قم بعملية الطرد المركزي بالسرعة القصوى لمدة 20 دقيقة. وعند اكتمال عملية الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة، أخرج الأنبوب برفق من جهاز الطرد المركزي مع الحرص على عدم تحريك راسب CD NA. يجب أن يكون لون الراسب وردياً بسبب صبغة الترسيب، وأن يكون حجمه تقريباً بحجم حبة ملح.

وعلى جانب الأنبوب أسفل المفصل، ضع حبيبات CD NA على الثلج وابدأ فوراً في تنظيف الحبيبات. لبدء إجراء تنظيف حبيبات CD NA، استخدم ماصة دقيقة P 1000 لإزالة كل السائل الطافي من الأنبوب بعناية. احرص على عدم تحريك الحبيبات.

أضف 500 µL من الإيثانول البارد بتركيز 80% إلى أنبوب العينة. أغلق الأنبوب برفق واقلبه ببطء عدة مرات. راقب الراسب بدقة شديدة للتأكد من عدم انفصاله عن جدار الأنبوب.

إذا انفصل الراسب، يمكنك إعادته إلى قاع الأنبوب إما عن طريق وضع الأنبوب مرة أخرى في الحامل وترك الراسب يستقر في القاع، أو عن طريق طرد الأنبوب مركزيًا بالسرعة القصوى لمدة 15 ثانية. بعد ذلك، استخدم ماصة دقيقة P 1000 لإزالة الإيثانول بعناية دون تعكير الراسب. قم بإمالة الأنبوب للسماح بإزالة أكبر قدر ممكن من السائل.

أضف كمية جديدة من الإيثانول البارد بنسبة 80%، ثم أغلق الأنبوب بإحكام واقلبه ببطء عدة مرات. بعد إزالة أكبر قدر ممكن من الإيثانول باستخدام ماصة دقيقة P 1000، قم بطرد الأنبوب مركزياً بالسرعة القصوى لمدة خمس ثوانٍ.

بعد ذلك، استخدم ماصة دقيقة P 10 لإزالة الميكرولترات القليلة المتبقية من الإيثانول دون تعكير الراسب. ضع الأنبوب المفتوح في صندوق تجفيف لمدة تتراوح من 10 إلى 20 دقيقة لتبخير الإيثانول المتبقي. يسهل فقدان الراسب بمجرد جفافه، لذا يجب الحرص على التعامل مع الأنبوب بلطف وإغلاق الغطاء.

عندما تكتمل عملية التجفيف، قم بمعاينة الراسب المجفف للتأكد من وجوده في الأنبوب. وأخيرًا، قم بإعادة تعليق الراسب المجفف في 22 microliters من الماء الخالي من RNA وضع الأنبوب على الثلج. يُستخدم هذا الـ CDNA بعد ذلك لتحضير CRNA مُسمى بالبيوتين عن طريق النسخ المختبري باستخدام طقم Enzo BioArray.

بعد تنقية وتقدير كمية الـ CRNA المسمى بالبيوتين، يتم تكسيره لتحضير الهدف. وبمجرد توليد الـ CDNA، نستخدم منهجية النسخ القياسية في المختبر (in vitro transcription) من أجل توليد CRNA مسمى بالبيوتين. يجب أن يخضع الـ CRNA لعملية التكسير قبل أن يتم تطبيقه على شريحة المصفوفة الدقيقة (microarray chip).

لبدء هذا الإجراء، قم بنقل كمية تعادل 5 µg من CRNA إلى أنبوب PCR سعة 0.5 mL مُسمى. أضف كمية كافية من مياه RNA-free لرفع الحجم الإجمالي إلى 16 µL، ثم أضف 4 µL من محلول fragmentation buffer بتركيز 5x إلى الأنبوب. يجب أن يكون الحجم الإجمالي في الأنبوب 20 µL.

قم برج الأنبوب باستخدام جهاز المرج (vortex) ثم قم بطرده مركزياً لمدة 10 seconds. بعد ذلك، قم بحضن الأنبوب عند درجة حرارة 94 °C لمدة 30 minutes. وفي جهاز التدوير الحراري (thermocycler)، ضع الأنبوب على الثلج بعد انتهاء فترة الحضن.

يتم بعد ذلك تقييم الـ CRNA المجزأ وغير المجزأ من كل عينة عن طريق الفصل الكهربائي باستخدام هلام AROS مسبق الصب بنسبة 1.2%. وعند اكتمال عملية الفصل، يتم تصوير الهلام باستخدام جهاز transluminator والتقاط صورة له. يتم تهجين منتج التصنيع النهائي مع شرائح جينات خميرة atric، وتظهر هنا النتائج التمثيلية لتحليل المصفوفات الدقيقة (microarray).

يعد هذا الشكل الأول مثالاً لصورة ممسوحة ضوئياً لشريحة جينات الخميرة من atrics، والتي تم إنشاؤها بواسطة برنامج تشغيل شريحة جينات atrics. هذا مخطط تشتت ثنائي الأبعاد لجميع النسخ الجينية، لنحو 6,700 جين تقارن بين بيانات الخميرة الضابطة والمعالجة. تمثل كل نقطة جيناً واحداً.

تشير الجينات الملونة باللون الأرجواني إلى الجينات ذات التعبير المتباين، بينما الجينات الملونة باللون الأحمر ليست كذلك. في هذا المثال، معظم الجينات ذات التعبير المتباين هي تلك المشاركة في التحكم في دورة الخلية كما يتضح من وصفها. يوضح هذا المخطط الانسيابي المستمد من قاعدة البيانات للتصور التوضيحي للتوصيف والاكتشاف المتكامل الجينات ذات التعبير المتباين في مسار بيولوجي متأثر.

تشير الجينات المحددة بنجمة حمراء إلى الجينات التي انخفض تعبيرها في مسار الانقسام الفتيلى. وأخيراً، تظهر هنا نتائج نموذجية لمخطط بركاني (volcano plot) تم إنشاؤه باستخدام برنامج geo species gene sifter. وقد تمت مقارنة العينات الضابطة والمعالجة باستخدام قيمة P-value حدية تبلغ 0.05 وحد تعبيري يبلغ 1.5 ضعف.

لقد اخترنا استخدام الخميرة لأنها سهلة النمو والسريعة، ولكننا أدركنا أيضاً أن الجزء الأكثر أهمية عند العمل مع الخميرة هو في الواقع إنشاء طبق مناسب للكرات البلازمية. ومن الأمور التي لا نرغب في القيام بها في تحليل المصفوفات الدقيقة هي إجراء عملية هضم غير مكتملة بحيث تقتصر الكرات البلازمية فقط على الخلايا التي تمر بمرحلة G1 أو مرحلة G2/M. وبذلك ستكون قد أجريت تجربة المصفوفات الدقيقة على خميرة تمر بمرحلة تضاعف معينة.

هناك نقطة معقدة أخرى نحاول توضيحها في هذا التمرين، وهي أن ترسيب DNA التي يتحدث عنها الجميع يومياً ليست عملية سهلة بالضرورة. وما قمنا به في هذه الوحدة التعليمية هو استخدام أنابيب متخصصة وكواشف تصويرية؛ بحيث يمكننا تدوير DNA وترسيبه ومن ثم رؤية الراسب بصرياً، مما يسهل العملية على الطلاب والمعلمين على حد سواء.

وبذلك يمكن استخدامه في جميع مراحل العمل على DNA وRNA بعد تطويره. لقد مهدت هذه الوحدة الطريق فعلياً لأعضاء هيئة التدريس في معاهد البكالوريوس للاستكشاف، وربما النظر في كائنات نموذجية أخرى أو أنظمة علاجية أخرى قد تكون متوافقة مع المناهج الدراسية الحالية أو ربما مع اهتماماتهم البحثية الخاصة. ولإعطائكم مثالاً على بعض التعديلات التي أجريت، كان هناك أحد المواقع الذي درس تأثيرات المعالجة بمبيدات الأعشاب على الخميرة، أو موقع آخر درس المعالجة بـ LAMP IDE في الخميرة، بينما نظر موقع ثالث في التغيرات التنموية في خط خلوي ثديي كانوا مهتمين به بشكل خاص.

وأخيرًا، بحث موقع آخر في تأثير مصادر الضوء المتباينة على نبات arabidopsis أو النباتات بشكل عام. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد تجربة مصفوفة دقيقة (microarray) مع طلاب العلوم في المرحلة الجامعية، بما في ذلك عزل RNA الكلي من الخميرة، وتوليد cDNA، وتجزئة cRNA المسمى بالبيوتين. تساعد التجارب العملية باستخدام مثل هذه التقنيات المتقدمة في تعزيز وتقوية تعليم العلوم للمرحلة الجامعية.