الاستفادة المشتركة منهجيات لتحديد دور البلازما غشاء تسليم خلال أكسون التشعب والعصبية التشكل

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء ملاحظات قابلة للقياس الكمي للحدوث الزمني والمكاني للحويصلة الخارجية العصبية fushion والتفرع المحوري. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب ، مثل متى وأين يدخل اندماج الحويصلة مادة الغشاء في غشاء البلازما المتوسع أثناء تطور الخلايا العصبية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تجمع بين تصوير الخلايا الحية للحصول على دقة مكانية وزمانية عالية في الخلايا المفردة والأساليب الكيميائية الحيوية للحصول على المعلومات القائمة على السكان.

بعد زراعة ومحاكاة الخلايا العصبية القشرية باستخدام Netrin-1 أو عنصر تحكم وفقا لنص البروتوكول. استنشق PBS من البئر الأول للحالة واستبدلها ب 250 ميكرولتر من مخزن التجانس. احتضن على الجليد لمدة خمس دقائق ، ثم باستخدام رافع الخلايا ، قم بتجانس الخلايا على الجليد.

استنشق PBS من البئر التالي من نفس الحالة وأضف الخليط المتجانس حديثا إلى البئر مما يزيد من تركيزات البروتين. بعد ذلك ، انقل المحلول المتجانس إلى أنبوب ميكرو فوج 1.6 مليلتر مبرد مسبقا على الجليد ، وأضف 20٪ Triton X-100 للوصول إلى تركيز نهائي قدره 1٪ ثم باستخدام ماصة 1 ، 000 ميكرولتر ، قم بتربيع الخليط عشر مرات مع تقليل الفقاعات. احتضان الأنابيب على الجليد لمدة دقيقتين لإذابة البروتينات.

ثم جهاز الطرد المركزي عند 6 ، 010 RCF عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق لتكسير المادة غير القابلة للذوبان. انقل المادة الطافية لحالة الكذب إلى أنبوب جديد مبرد سعة 1.6 مليلتر على الجليد. بعد ذلك ، استخدم اختبار برادفورد لتحديد تركيز البروتين.

بعد ذلك ، استخدم مخزن التجانس مع 1٪ Triton X-100 و 5X المخزن المؤقت للعينة المكمل ب BME لتخفيف العينات إلى تركيز نهائي من 3-5 ملليغرام لكل مليلتر. قسم كل عينة تجريبية بالتساوي إلى أنبوبين. ثم احتضان عينة واحدة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، والأخرى عند 100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

اقلب الأنابيب بشكل متقطع للحفاظ على العينات في المحلول. ثم قم بتنفيذ صفحة SDS والنشاف الغربي وفقا لبروتوكول النص. بعد إعداد مجهر TIRF والعينة وإيجاد مستوى بؤري عصبي وفقا لبروتوكول النص.

ابدأ تشغيل برنامج الليزر واتصل ببرنامج التحكم بالليزر. اضبط الإضاءة على مجال واسع وحدد الهدف. ثم اضبط معامل الانكسار للعينة واضبط شدة الليزر عن طريق إلغاء تحديد TTL لليزر 491.

تحسين معلمات التصوير أمرا مهما أثناء تصوير الحويصلات الخارجية السليمة للأرضية لتجنب انجراف التركيز والسمية الضوئية أثناء إنتاج صور ذات نسبة إشارة عالية إلى ضوضاء كافية للتحليل. اضبط شريط التمرير على 100 ثم أخرجه إلى قيمة تتراوح بين 20 و 40. ثم أعد التحقق من TTL.

بعد ذلك ، ركز على العينة مرة أخرى في إضاءة الضوء المرسلة. ثم في برنامج التصوير ، حدد إضاءة الليزر 491 وافتح الغالق. ضع المكثف رأسا على عقب على المقعد البصري حتى لا تخدش العدسة.

اضبط النقطة المحورية لليزر على السقف بدقة ومع إزالة المكثف ، قم بتوسيط النقطة إلى مركز غشاء المجال المغلق. ثم استبدل المكثف وفي برنامج TIRF أرسل عمق الاختراق إلى 110 نانومتر. ثم قم بالتبديل من إضاءة المجال الواسع إلى وضع إضاءة TIRF للتصوير.

الآن ، باستخدام تألق التألق واسع المجال ، ابحث عن الخلايا الفلورية VAMP2 التي تعبر عن الخلايا من خلال العينين. ثم لتقليل التبييض الضوئي والسمية الضوئية ، اضبط معلمات التصوير لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء والنطاق الديناميكي باستخدام الحد الأدنى من وقت التعرض وشدة الليزر. اضبط التركيز البؤري التلقائي المستمر لكل خلية.

ثم احصل على مجموعة صور بفاصل زمني مع الحصول على كل 0.5 ثانية لمدة خمس دقائق. بالنسبة للحالة المحفزة Netrin-1 في غطاء التدفق الصفحي ، أضف إلى التركيز النهائي البالغ 500 نانوغرام لكل ملليلتر من Netrin-1 إلى طبق من الخلايا وأعد الطبق إلى الحاضنة لمدة ساعة واحدة قبل التصوير. لتحديد تواتر الأحداث الخارجية التي تم تطبيعها لكل منطقة ووقت الخلية.

في ImageJ، افتح مكدسات الصور عن طريق سحب الملف إلى النافذة أو عن طريق اختيار ملف ، فتح ، اسم الملف. لإزالة إشارات الفلورسنت المستقرة التي لا تمثل أحداث اندماج الحويصلة، استخدم الصورة والمكدس ومشروع Z ونوع الإسقاط متوسط الكثافة. لإنشاء متوسط إسقاط Z للمكدس بأكمله.

اطرح متوسط الصورة الناتجة من كل صورة في اللقطات المتتابعة باستخدام العملية ، حاسبة الصور ، الصورة 1 المكدس الخاص بك ، عملية طرح الصورة الثانية. مما أدى إلى إسقاط Z تم إنشاؤه حديثا. سيؤكد هذا على الأحداث الغريبة.

الآن بالعين ، قم بحساب أحداث الفوشيون الخارجية ، والتي يمكن تحديدها على أنها بقع من الحيود ، وإشارات الفلورسنت المحدودة التي تنتشر بسرعة مع انتشار فلورين VAMP2 داخل غشاء البلازما. قم بتمييز الصورة الأولى باستخدام Image وAdjust وThreshold واضبط شريط التمرير حتى يتم تمييز عتبة الخلية بأكملها. ثم ضمن تحليل، اختر تعيين القياسات وتحقق من المنطقة وتسمية العرض.

باستخدام أداة تتبع العصا ، اضبط المنطقة الخلوية العتبة واضغط على M للقياس. انقل البيانات التي تم جمعها إلى جدول بيانات وفقا لبروتوكول النص. في غضون يومين في المختبر ، ضع طبق التصوير السفلي الزجاجي الذي يحتوي على خلايا عصبية غير منقولة في غرفة بيئية رطبة دافئة مسبقا.

استخدم مجهرا مزودا بستة DX خطة apochromat 1.4 NA DIC عدسة موضوعية ومكثف فتحة عدمية عالية للحصول على أفضل جودة للصورة ودقة. بعد ذلك ، مع إضاءة الضوء المنقولة ، اضبط المستوى البؤري للعثور على الخلايا العصبية من خلال العينين. بالنسبة لتصوير DIC لتفرع المحاور العصبي ، سيكون الإعداد المناسب للإضاءة المبردة جزءا لا يتجزأ من تحسين الصورة وهو أمر بالغ الأهمية لإنتاج نتائج قابلة للتحليل.

بعد ذلك ، مع الخلايا العصبية ذات الأهمية في مجال الرؤية ، استخدم وظيفة اكتساب المناطق المتعددة في برنامج التصوير للعثور على مواقع XYZ لست خلايا على الأقل وحفظها. الآن ، أضف إلى التركيز النهائي البالغ 250 نانوغرام لكل مليلتر من Netrin-1 أو أي عامل آخر ذي أهمية لمحاكاة الخلايا واضغط على بدء الاستحواذ على مناطق متعددة. احصل على الصور بالتتابع في كل موضع كل 20 ثانية لمدة 24 ساعة.

إيقاف الاستحواذ مؤقتا وإعادة التركيز حسب الضرورة. داخل برنامج التصوير ، راجع الصور عن طريق اختيار التطبيقات ، ومراجعة البيانات متعددة الأبعاد وفتح الملف المطلوب. تحديد فروع المحور العصبي المستقرة التي تشكلت أثناء جلسة التصوير.

استخدم أداة منطقة التتبع لقياس فرع محور عصبي مستقر من قاعدة المحور العصبي إلى الحافة. بعد علاج الخلايا العصبية بتوكسين نيترين والبوتولينوم والتثبيت والتلوين المناعي والتلوين المناعي للبيتا 3 توبولين والأكتين وفقا لبروتوكول النص. استخدم مجهرا مقلوبا لجمع صور التألق العرضي واسعة المجال.

افتح مكدس صور في ImageJ ولتحليل خط استخدام التفرع يدويا ، وخط مجزأ وتتبع المحور العصبي الذي يعرف بأنه أطول عصبة عصبية تمتد من سوما. باستخدام التحليل والأدوات ومدير العائد على الاستثمار ، احفظ تتبع المحور العصبي كمنطقة اهتمام. ثم تتبع وحفظ كل فرع من فروع المحور العصبي ، والذي يعرف بأنه نيورايت أكبر من أو يساوي 20 ميكرومتر في الطول.

قم بتضمين الفروع الأساسية فقط في التحليل. تظهر هنا لطخة غربية بعد الانتهاء من اختبار مركب SNARE المقاوم ل SDS. تم التحقيق في SNAP25 و Syntaxin 1A و VAMP2.

عرض بروتينات SNARE في المونومرات المعقدة التي يمكن تحديدها هنا. يظهر هنا مثال على حدث غريب الرحمة بوساطة VAMP2 fluroen يحدث بمرور الوقت في الخلايا العصبية القشرية. تشير الإدخالات المكبرة إلى السوما ، وفرع المحور العصبي ، ومخروط النمو المحوري الذي يوضح المنفعة المكانية لهذا الفحص.

الدوائر بتفجير أحداث اندماج خارجي واحد ، والتي يمكن رؤيتها عبر الفحص المجهري TIRF. يظهر تصوير DIC بفاصل زمني تكوين Netrin المحفز لفرع محوري في الوقت الفعلي. تشير هذه المواقع إلى النتوء الأولي من موقع الفرع.

تمثل هذه فروعا مستقرة كاملة التكوين لا تقل عن 20 ميكرومترا مقاسة من المحور العصبي الرئيسي إلى طرف الفرع. في هذه التجربة ، تم التعامل مع الخلايا العصبية القشرية في 3 DIV إما باستخدام Netrin-1 ، الذي يحفز التفرع أو توكسين البوتولينوم A ، الذي يشق SNAP25 ، وهو أحد مكونات مركب SNARE ويمنع إفراز الخلايا. توضح النتائج أن إفراز الخلايا بوساطة SNARE ضروري للتفرع المعتمد على Netrin.

بمجرد إتقانه، يمكن إكمال تصوير DIC في جلسة تصوير واحدة بين عشية وضحاها. يمكن إدارة تصوير TIRF للأحداث الخارجية الفردية في غضون 4-5 ساعات. يمكن تنفيذ بروتوكول الكيمياء الحيوية لتكوين مجمع SNARE في غضون ساعتين.

أثناء محاولة هذه الإجراءات ، من المهم أن تتذكر أن تسرع نفسك ولا تتسرع في أي خطوة واحدة. يتطلب كل إجراء الانتباه والصبر للحصول على أفضل النتائج. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل نقل مكونات الحويصلة الموسومة مع الشحنات المرشحة الموسومة للإجابة على أسئلة إضافية.

مثل ما هي شحنة الحويصلات الخارجية؟ بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب لاستكشاف تكوين الخلايا العصبية ، وتفرع المحور العصبي ، والمراحل الأخرى في التشكل العصبي في أي ثقافة عصبية منفصلة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية مراقبة وتحديد الطبيعة المكانية والزمانية لأحداث اندماج الحويصلة الخارجية العصبية المقابلة للتغيرات في مورفوجين الخلايا العصبية.

لا تنس أن العمل مع توكسين البوتولينوم أو الليزر عالي الطاقة يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء ملابس السلامة المناسبة واستخدام آلية قفل الأمان المجهر أثناء تنفيذ هذا الإجراء.