تشريح للدالة محسن باستخدام محسن متعدد المستندة إلى كريسبر التدخل في خطوط الخلايا

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الجينوم وتنظيم الجينات ، مثل كيفية عمل المناطق التنظيمية الجينية المتعددة ، والمعروفة أيضا باسم المعززات ، معا للتحكم في النسخ. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن اختبار معززات متعددة بالقرب من جينات مختلفة متعددة في وقت واحد من أجل تحديد المناطق التي تشارك في تنظيم الجينات بسرعة. لبدء تصميم دليل الحمض النووي الريبي ، قم أولا بإنشاء تسلسلات الحمض النووي كما هو موضح في بروتوكول النص.

استخدم برنامجا مثل E-CRISP على تسلسلات الحمض النووي التي تم إنشاؤها للعثور على الحمض النووي الريبي الإرشادي ذي الأهداف المنخفضة. تتكون الحمض النووي الريبي الإرشادي من 20 نيوكليوتيدات في اتجاه المنبع من شكل مجاور للفاصل الأولي ، والذي يأخذ شكل NGG ل dCas9 من S.pyogenes. على موقع E-CRISP على الويب ، حدد الكائن الحي المعني باستخدام القائمة المنسدلة.

يظهر تجميع الجينوم على يمين اسم النوع. حدد زر الاختيار تسلسل الإدخال هو FASTA. انسخ تسلسلات FASTA من الأعلى والصقها في مربع الحوار.

تأكد من تضمين رأس FASTA لكل تسلسل. حدد زر الاختيار المتوسط والتصميم الفردي في القائمة المنسدلة. انقر فوق الزر بدء بحث الحمض النووي الريبي الفردي.

سيتم فتح علامة تبويب متصفح جديدة وسيتم عرض النتائج. قم بتنزيل تسلسلات المرشحين بالنقر فوق الزر ، قم بتنزيل تقرير جدولي تمت صياغته من Excel لجميع تسلسلات الاستعلام معا. بعد ذلك ، استخدم متصفح الجينوم UCSC لتوجيه تسلسل الحمض النووي الريبي الكامل لمرشح BLAT إلى الجينوم.

في المستعرض، انتقل إلى موقع الويب الخاص بمتصفح الجينوم UCSC. ضمن قسم أدواتنا ، حدد موقع كلمة BLAT وانقر عليها. سيتم فتح أداة بحث BLAT.

استخدم القوائم المنسدلة الموجودة أسفل نص جينوم بحث BLAT لتحديد الكائن الحي وتجميع الجينوم محل الاهتمام. انسخ تسلسلات الحمض النووي الريبي الإرشادية من التقرير الجدولي الذي تم إنشاؤه بواسطة E-CRISP والصقه في مربع الحوار. تأكد من أن كل تسلسل يحتوي على رأس FASTA فريد ، ثم انقر فوق إرسال في أسفل مربع الحوار.

في صفحة نتائج بحث BLAT ، ستظهر محاذاة كل تسلسل RNA دليلي ، مع تمثيل كل سطر محاذاة. من الناحية المثالية ، يجب أن يكون هناك محاذاة واحدة لكل دليل RNA ، مما يشير إلى تفرد هذا الدليل RNA. تجنب الأدلة التي تعين مواقع متعددة في الجينوم ، إن أمكن.

لفحص توطين الحمض النووي الريبي الإرشادي وتوزيعه داخل المنطقة التي تهمك ، انقر فوق رابط المتصفح ضمن قسم الإجراءات لأحد الحمض النووي الريبي الدليل الذي تم الاستعلام عنه. سيظهر متصفح الجينوم ، وسيتمركز على دليل الحمض النووي الريبي المحدد. استخدم أزرار التصغير في أعلى الصفحة لتصور توزيع الحمض النووي الريبي الإرشادي الآخر الذي تم تحديده بواسطة E-CRISP داخل منطقة الاهتمام.

حدد أربعة ، ويفضل أن تكون غير متداخلة ، توجيه الحمض النووي الريبي الإرشادي الموزعة في جميع أنحاء المنطقة ذات الاهتمام. إذا تجاوزت منطقة الاهتمام 600 زوج أساسي، ففكر في إضافة دليل إلى دليلين إضافيين. تجنب الحمض النووي الريبي التوجيهي مع امتدادات البوليمر المتجانس ومحتوى GC الشديد ، حيث يمكن أن تعيق هذه الميزات عملية استنساخ الحمض النووي الريبي الإرشادي وتقلل من كفاءة استهداف الحمض النووي الريبي التوجيهي.

أعد تكوين دليل الحمض النووي الريبي oligos بتركيز نهائي يبلغ 100 ميكرومولار في ماء فائق النقاء. يجب أن يكون هناك ما لا يقل عن أربعة قلات RNA إرشادية منفصلة لكل منطقة ذات أهمية. لكل منطقة تنظيمية ذات اهتمام ، قم بإنشاء مجموعة من جميع oligos المقابلة لمنطقة الاهتمام.

في أنبوب Eppendorf ، اجمع بين خمسة ميكرولترات من كل دليل فردي معاد تكوينه RNA oligo لكل منطقة. امزج المسبح جيدا عن طريق الدوامة ، ثم قم بإزالة ميكرولتر واحد وقم بتخفيف هذا البلياق من 1 إلى 200 في ماء فائق النقاء. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل قصير باستخدام بادئات USICS لإرفاق مناطق التماثل ب oligos كما هو مفصل في بروتوكول النص.

ستتم إضافة حوالي 40 قاعدة إلى كل oligo ، مما ينتج عنه منتج تقريبي من 100 زوج أساسي يحتوي على تماثل كاف لشبح USIC على كلا الطرفين. بعد ذلك ، قم بإعداد ردود فعل جمعية جيبسون على الجليد. استخدم 50 نانوغراما من المتجه المهضوم وسبعة نانوغرامات من الملحق في تفاعل 20 ميكرولتر.

أيضا ، قم بإعداد تفاعل Gibson Assembly المهضوم فقط باستخدام 50 نانوغرام من المتجه ، واستبدال الملحق بالماء. احتضان تفاعلات جمعية جيبسون لمدة 15 دقيقة عند 50 درجة مئوية ، تليها تعليق عند 4 درجات مئوية. بعد نقل المنتجات المجمعة إلى الثلج ، قم بتخفيفها من 1 إلى 4 في ماء فائق النقاء على الجليد.

على سبيل المثال ، أضف خمسة ميكرولترات من منتج Gibson Assembly إلى 15 ميكرولترا من الماء فائق النقاء. بعد ذلك ، قم بتحويل منتجات Gibson Assembly المخففة. قم بإسقاط الخلايا المختصة عالية الكفاءة على الجليد ، واصنع 25 ميكرولتر لكل تحول.

إذا كان هناك رغبة في وجود تجمع معقد يستهدف مواقع متعددة ، فقم بإسقاط خلايا كافية في أنابيب مختلفة لإجراء تحويلات مستقلة متعددة. ضع 50 ميكرولترا من الخلايا المحولة ، وضع الألواح في حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل. بالنسبة للتحضيرات المصغرة للتجمعات التي تستهدف المواقع الفردية ، ضع الخلايا مباشرة في ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من مرق LB الذي يحتوي على أمبيسلين أو كاربينيسيلين.

احتضان الخلايا طوال الليل مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية. بالنسبة للمكتبات الكبيرة ، استخدم مكشطة الألواح لجمع جميع المستعمرات من كل لوحة فردية في إعداد ماكسي واحد. يمكن تسهيل ذلك عن طريق سكب ما يقرب من خمسة ملليلتر من LB مع المضاد الحيوي المناسب في أنبوب فالكون سعة 15 مليلتر ، وكشط المستعمرات في الأنبوب.

في اليوم السابق للتعداء ، قم بوضع الخلايا في صفيحة من 24 بئرا ، عند التقاء 30 إلى 50٪. قم بتجميع خلايا كافية بحيث يمكن إجراء عمليات النقل بشكل مكرر ، وتشمل الآبار التي سيتم نقلها باستخدام الحمض النووي الريبي لدليل التحكم. تأكد من توزيع الخلايا بالتساوي عبر البئر ، عن طريق هز اللوحة برفق بعد طلاء الخلية.

رج العبوة كل خمس دقائق في أول 15 دقيقة. في اليوم التالي ، قم بإعداد عمليات الإرسال وفقا لتعليمات كاشف التعدي المفضل. بالنسبة لخلايا إيشيكاوا ، استخدم 550 نانوغراما من البلازميد الكلي لكل بئر من صفيحة 24 بئرا.

خفف البلازميدات إلى تركيز نهائي قدره 020 ميكروغرام لكل مليلتر في وسائط خالية من المصل. استخدم ثلاثة ميكرولترات من كاشف التعدي لكل ميكروغرام واحد من الحمض النووي ، والدوامة برفق ، واحتضن لمدة خمس إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أضف 25 ميكرولترا من الخليط النهائي إلى كل بئر.

قم بإعداد كمية كافية من المخزن المؤقت للتحلل باستخدام 1٪ بيتا ميركابتو إيثانول. استنشق الوسائط باستخدام شفاط فراغ. اغسل الخلايا مرة واحدة بحجم متساو 1x PBS ، واستنشق لإزالة أكبر قدر ممكن من PBS.

أضف 300 ميكرولتر من محلول تحلل BME إلى كل بئر، باستخدام ماصة متعددة القنوات. ماصة محلول التحلل لأعلى ولأسفل من ثماني إلى عشر مرات ، ونقلها إلى صفيحة بئر عميقة أو أنابيب إيبندورف سعة 1.7 مليلتر على الجليد. يمكن استخراج الحمض النووي الريبي على الفور ، أو يمكن تجميد المحللات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر للمعالجة المستقبلية.

يتم عرض تصميمات دليل الحمض النووي الريبي لمواقع ربط عامل النسخ الثلاثة بالقرب من MMP17. المنطقة المستهدفة هي موقع الربط ل ER alpha كما هو محدد بواسطة ChiP-seq ، وتجانب RNAs الأربعة عبر هذه المنطقة. يظهر هنا منتج الحمض النووي الريبي الإرشادي المتوقع بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل القصير ، باستخدام الاشعال الداخلية ل USIC.

سيضيف التفاعل 20 زوجا أساسيا من التسلسل إلى كل طرف من أجزاء الحمض النووي الريبي لتوجيه زوج القاعدة المكون من 59 زوجا ، مما ينتج عنه تسلسل تقريبي من 100 زوج أساسي. يتم عرض نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل النوعي من تجربة Enhancer-I في MMP17. يشار إلى المواقع التي يستهدفها Enhancer-I بمسدس أسود.

الموقعان 1 و 2 ضروريان للاستجابة الكاملة للاستروجين ل MMP17 ، بينما لا يساهم الموقع 3. يمكن أن يساهم الموقع 1 في بعض التعبير عن نفسه ، ولكن يظهر أكبر نشاط عندما يكون الموقعان 1 و 2 نشطين. بمجرد تحسينها لخط الخلية محل الاهتمام ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون خمسة إلى سبعة أيام ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصميم الحمض النووي الريبي الإرشادي ل Enhancer-I ، وإنشاء ونقل مجموعات معقدة من الحمض النووي الريبي الإرشادي ، وحصاد الخلايا المنقولة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم الحفاظ على بيئة زراعة الأنسجة المعقمة ، واستخدام مواد خالية من RNase و DNase. باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق أخرى ، مثل ChiP-seq و RNA-seq ، للإجابة على أسئلة إضافية ، مثل مكان ارتباط Enhancer-I في الجينوم ، وكيف يؤثر على التعبير الجيني العالمي.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لاستكشاف تنظيم الجينات الناجم عن هرمون الاستروجين في المواقع الداخلية في الجينوم البشري ، بدلا من استخدام المراسلين العرضيين. لا تنس أن العمل في إعدادات زراعة أنسجة الثدييات يمكن أن يكون خطيرا ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية ، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.