أسلوب حجمي للتحديد الكمي للمخ بالتشنج في نموذج موريني نزيف تحت العنكبوتية
يوليو 28, 2018
والهدف من هذه المادة هو تقديم أسلوب يسمح بإعادة بناء ثلاثي الأبعاد لشجرة الأوعية الدموية للمخ في الفئران بعد الدقيقة المحسوبة التصوير المقطعي وتحديد كميات من شرائح كامل السفينة التي يمكن استخدامها لقياس بالتشنج الدماغي في مورين نماذج من نزيف تحت العنكبوتية.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد التشنج الوعائي الدماغي في الفئران ، بعد تحريض النزيف تحت العنكبوتية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إخضاع للتروية عبر القلب والصب داخل الأوعية الدموية ، باستخدام عامل صب ظليلة للإشعاع. الخطوة التالية هي الحصول على بيانات الصورة المقطعية ، عن طريق تعريض الدماغ للتصوير المقطعي بالحواسيب الصغيرة.
ثم تتم معالجة الصورة والبيانات. يستخدم برنامج Miro لإعادة بناء شجرة الأوعية الدموية داخل الجمجمة فعليا ولحساب أحجام أجزاء الأوعية الدموية المحددة ، والتي تمثل مقياسا موضوعيا لتحديد تشنج الأوعية الدموية. يحدث نزيف تحت العنكبوتية في الفئران عن طريق ثقب خيوط الأوعية الدموية تحت التخدير باستخدام الأيزوفلوران.
يتم تحضير الشريان السباتي الخارجي الأيسر جراحيا. ثم يتم إدخال خيوط في الشريان السباتي الخارجي وتتقدم داخل الجمجمة من خلال الشريان السباتي الداخلي ، والذي يتم ثقبه في الشريان السباتي t ، مما يؤدي إلى نزيف تحت العنكبوتية. يؤخذ ارتفاع الضغط داخل الجمجمة كمؤشر على نجاح الانثقاب داخل الأوعية الدموية.
لتحليل التشنج الوعائي ، قم بتحفيز التخدير. استمر فقط بعد الوصول إلى مستوى التخدير الكافي ، وهو ما يؤكده عدم وجود ردود فعل على محفزات الألم. قم بإجراء نضح عبر القلب باستخدام المحاليل التالية.
محلول ملح فسيولوجي يحتوي على التركيزات الفسيولوجية للصوديوم والبوتاسيوم والكالسيوم والمغنيسيوم عند درجة حموضة سبعة نقاط أربعة. وبعد ذلك ، حل 4٪ PFA. ابدأ الوفرة بالمحلول رقم واحد لمدة دقيقتين واستمر في المحلول الثاني لمدة أربع دقائق.
قم بنقع المحاليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية واستخدم مضخة يتم التحكم فيها بالضغط بمعدل تروية متغير لنفخ ضغط ثابت يبلغ 70 ملم من الزئبق. تجنب فقدان الضغط عند التبديل من الحل الأول إلى الحل الثاني. بعد التروية بكلا المحاللين ، استمر في التروية لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام عامل صب ظليل للإشعاع بمعدل ثابت من نقطة ملليلتر في الدقيقة.
امسك العينة لمعالجة مادة صب الظليلة المشعة عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. وقم بإزالة الدماغ وتخزين العينة عند أربع درجات مئوية في محلول 4٪ PFA حتى يتم ضبطه بشكل دقيق. ضع الدماغ في منتصف أنبوب بلاستيكي باستخدام ملقط تشريحي غير حاد.
اختر أنبوبا بقطر أكبر قليلا من العينة ، للتأكد من أن الكائن لا يتحرك أثناء الحصول على الصورة. استخدم الشاش لإغلاق الأنبوب. قم بتوصيل الأنبوب البلاستيكي من خلال محرك متدرج صغير لنظام تحديد المواقع للتحكم في الكمبيوتر في كابينة الأشعة السينية ، حيث يتم تدوير الكائن حول محوره الأفقي.
قم بمحاذاة العينة في مجال الرؤية تحت التصوير الشعاعي بالأشعة السينية. لتحقيق أقصى قدر من التكبير ، ضع الجسم في أقرب مكان ممكن من مصدر الأشعة السينية وقم بزيادة المسافة إلى الكاشف قدر الإمكان. استخدم بروتوكول الحصول على الصور خطوة والتصوير باستخدام معلمات المسح الضوئي التالية.
اضبط وقت التعرض على ثانية واحدة لكل إسقاط واستخدم جهد أنبوب يبلغ 80 كيلو فولت لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء. اضبط عدد الإسقاطات على 1,000 لدورة واحدة. لإعادة بناء البيانات الأولية ، استخدم خوارزمية الإسقاط الخلفي المصفاة ، مما يعني مرشح Shepp-Logan بمصفوفة من 1 ، 024 فوكسل مكعب.
قم باستيراد بيانات dicom إلى برنامج Miro باستخدام استيراد الوظيفة. تصور شجرة السفينة باستخدام الدالة vol-run. اختر عتبة التصور بحيث يتم تصوير الشرايين الدماغية الكبيرة في مخططات حادة.
من المهم استخدام نفس عتبة التصور لجميع مجموعات البيانات التي تنتمي إلى السلسلة التجريبية. قم بتشريح الشرايين الدماغية القاعدية لدائرة ويليس تقريبا ، مع إضافة حجم وظيفة من خلال إحاطة الأوعية بالمنطقة الدقيقة. ثم قم بتشريح جزء الوعاء المراد تحليله تقريبا.
لذلك ، قم بتدوير النموذج ثلاثي الأبعاد لشجرة الأوعية الدموية من أجل فصل جميع الفروع الصغيرة بدقة عن الشريان الرئيسي. من الضروري لمزيد من التحليل حذف جميع السفن باستثناء جزء السفينة المراد تحليلها. قم بتطبيق الهيكل العظمي التلقائي للدالة مع تعيين العتبة على عتبة التصور ، والتي تنشئ خطا مركزيا ، رسم بياني مكاني قائم على الخط.
ثم قم بتطبيق الرسم البياني المكاني للدالة على مجموعة الأسطر ، لإنشاء مجموعة خطوط. قسم مجموعة الأسطر إلى مقاطع فرعية فردية عن طريق اختيار المقاطع الفرعية الفردية يدويا باستخدام المؤشر والنقر فوق التقسيم. هذه الخطوة حاسمة لحساب أحجام المقاطع الفرعية الفردية.
استخدم سطر الدالة الذي تم تعيينه على الرسم البياني المكاني لإنشاء رسم بياني مكاني مرة أخرى. استخدم إحصائيات الرسم البياني المكاني للدالة لتحديد طول وحجم وقطر كل مقطع فرعي. للتصور المرمز بالألوان ، الذي يمثل مسار قطر الوعاء استخدم عرض الرسم البياني المكاني للوظائف.
اضبط تلوين القطعة على السماكة ، والتي ترتبط بقطر الوعاء. من المهم اختيار نفس خريطة الألوان لجميع مجموعات البيانات التي تنتمي إلى السلسلة التجريبية. أضف أطوال الأجزاء الفرعية لتحديد الأجزاء الفرعية التي سيتم تضمينها في التحليل الإضافي.
في هذه الدراسة ، قمنا بتقييم جزء من الوعاء الدموي يتكون من ملليمتر واحد من الشريان السباتي الداخلي ، وقريب من الشريان السباتي t ، ونقطتين خمسة ملليمترات من الشريان الدماغي البعيد للشريان السباتي. ثم أضف الأحجام لتحديد حجم الوعاء لجزء الوعاء المحدد. لتقييم دقة إعادة البناء الافتراضية لشجرة الأوعية الدموية ، أجرينا المقارنة القائمة على القطر بين أقطار الأوعية المحددة مجهريا ومن عمليات إعادة البناء الافتراضية ثلاثية الأبعاد في نقطتين محددتين تشريحيا في عشر عينات من الدماغ.
للتحديد المجهري لأقطار السفينة ، وكاميرا عالية الدقة ، وأداة معايرة برمجية ، ومقاييس ميكرومتر مستخدمة ، لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية بين الأقطار المحددة مجهريا وافتراضيا. مما يشير إلى إعادة بناء افتراضية دقيقة لتشريح الأوعية الدموية داخل الجمجمة. لتحديد التشنج القاعدي الدماغي ، حددنا حجم مقطع وعاء ممثل محدد مسبقا من ثلاث نقاط خمسة ملليمترات ، يتكون من مليمتر واحد IC8 ونقطتين خمسة ملليمترات MCA على اليسار.
في عينات الدماغ من SAH التي تم تشغيلها الوهمية. كان حجم الأوعية الدموية أقل بكثير في SAH مقارنة بالوسام ، مما يشير إلى تشنج الأوعية الدموية الدماغية. كانت أقطار السفينة أيضا أقل بكثير في SAH مقارنة بالوهم.
تعكس إعادة البناء الافتراضية التي تم تحقيقها بالطريقة المعروضة هنا تشريح الأوعية الدموية بدقة. يمكن فحص أجزاء الوعاء بأكملها ، ويفترض أن تقدم معلمة أكثر موضوعية لتحديد التشنج الوعائي من تحديد أقطار الوعاء عند نقطة واحدة. يؤدي التقييم الحجمي إلى اختلافات أكبر بين الأوعية الدموية والأوعية غير الوعائية مقارنة بتقييم أقطار الأوعية الدموية فقط.
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد لشجرة الأوعية الدموية الدماغية في الفئران باستخدام التصوير المقطعي المحوسب المجهري لتحديد كمية التشنج الوعائي الدماغي بعد النزف تحت العنكبوتية. تجمع التقنية بين التروية القلبية، الصب الداخلي للأوعية، ومعالجة الصور المتقدمة لقياس أحجام الأوعية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الأبحاث الدماغية الوعائية
- تقنيات التصوير
الخلفية
- التشنج الوعائي الدماغي هو أحد المضاعفات الخطيرة بعد النزف تحت العنكبوتية.
- فهم الاستجابات الوعائية ضروري لتطوير استراتيجيات علاجية.
- يمكن أن يوفر إعادة البناء ثلاثي الأبعاد رؤى حول التغيرات الوعائية وتحديد شدة التشنج الوعائي.
- قد تفتقر الطرق الحالية إلى الدقة في قياس التغيرات الوعائية بعد الإصابة.
هدف الدراسة
- لتأسيس تقنية موثوقة لتحديد كمية التشنج الوعائي الدماغي في الفئران.
- لتحسين فهم التغيرات الدماغية الوعائية بعد النزف تحت العنكبوتية.
- لتسهيل التقييم الموضوعي للمورفولوجيا الوعائية ووظيفتها.
الطرق المستخدمة
- استخدمت الدراسة التصوير المقطعي المحوسب المجهري لتصوير النظام الوعائي الدماغي.
- تعرضت الفئران لصب داخل الأوعية بعد النزف تحت العنكبوتية المستحث.
- تضمنت الخطوات الرئيسية التروية القلبية بالمحاليل الفسيولوجية وعوامل الصب المشعة.
- تمت معالجة الصور والبيانات باستخدام برنامج Miro لتصور وتحليل هياكل الأوعية.
- تمت مقارنة القياسات الدقيقة لأقطار الأوعية بين إعادة البناء المجهري والظاهري.
النتائج الرئيسية
- سمحت الطريقة بإعادة البناء ثلاثي الأبعاد الدقيقة لشجرة الأوعية الدموية داخل الجمجمة.
- لم تكن هناك اختلافات كبيرة في قياسات قطر الأوعية بين الطرق المجهرية والظاهرية، مما يدل على دقة عالية.
- قدمت تحليل قطاعات الأوعية مقاييس موضوعية لتقييم شدة التشنج الوعائي.
- أبرزت الدراسة أهمية استخدام عتبات تصوير موحدة للحفاظ على الاتساق عبر مجموعات البيانات.
الاستنتاجات
- تظهر هذه الدراسة طريقة جديدة ودقيقة لتقييم التشنج الوعائي الدماغي في نماذج الفئران.
- تعزز القدرات على تحديد كمية التغيرات الوعائية بعد الإصابة النزفية.
- تمتلك النتائج آثارًا مهمة لفهم الديناميكيات الدماغية الوعائية وتطوير نهج علاجية جديدة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Quantifying cerebral vasospasm in preclinical models remains a critical challenge in stroke drug development, where objective vascular metrics are needed to de-risk mechanistic hypotheses and support go/no-go decisions. This volumetric method provides a reproducible, imaging-based readout that enhances predictive confidence in target validation by moving beyond single-point diameter measurements to integrated vessel segment analysis. Its application in murine SAH models enables standardized assessment of vascular pathology, supporting translational continuity from discovery through preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by providing objective volumetric metrics of cerebral vasospasm as a pathophysiological endpoint.
- Operational Value: Supports biological de-risking through accurate 3D reconstruction of the cerebrovascular tree, reducing reliance on indirect or single-point measurements.
- Predictive Value: Enhances target confidence by quantifying vascular changes across entire vessel segments, improving correlation with functional outcomes in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative vessel volume outputs that enable reliable comparison between experimental conditions in vasospasm models.
- Operational Value: Establishes a reproducible workflow combining transcardiac perfusion, endovascular casting, and micro-CT imaging for consistent vascular phenotyping.
- Scalability: Facilitates platform reuse across studies by maintaining fixed visualization thresholds and segmentation protocols for longitudinal or comparative analyses.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase vascular quantification to preclinical validation by providing a disease-relevant system that mirrors clinical vasospasm pathology.
- Mechanistic De-risking: Enables objective assessment of vasospasm severity, supporting risk-adjusted advancement decisions in preclinical pipelines.
- Predictive Confidence: Volumetric evaluation demonstrates greater sensitivity to vasospastic changes than diameter-only metrics, improving the predictive value of preclinical findings.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis testing in early discovery, assay readiness in screening, and vascular phenotype validation in translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying vasospasm as a measurable biological response to subarachnoid hemorrhage.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative vascular outputs with high reproducibility, enabling reliable compound or genotype comparisons.
- Analytics: Provides volumetric, length, and diameter measurements from spatial graph statistics, offering multidimensional readouts for condition comparison.
- Translational Research: Aligns with preclinical continuity by delivering disease-relevant vascular metrics that can inform biomarker-aligned efficacy assessments.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized vascular quantification platform applicable across multiple cerebrovascular injury models beyond SAH.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through objective, volumetric quantification of cerebral vasospasm.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via fixed imaging thresholds, perfusion protocols, and semi-automated 3D reconstruction workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in vasospasm modeling, lowering late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on robust preclinical vascular phenotype data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, perfusion techniques, and micro-CT operation for successful vascular casting and imaging.
- Depends on access to microcomputed tomography systems and 3D visualization software (e.g., Miro) for image acquisition and analysis.
- Necessitates cross-team standardization of visualization thresholds and segmentation protocols to ensure consistency across experimental groups.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different vessel segments or model systems, validated through diameter-based accuracy checks.
- Limited by the ex vivo nature of the assay, which captures endpoint vascular morphology but not real-time dynamic vasospasm progression.
