إنتاج E.القولونية - أعرب الذاتي تجميع البروتين الجسيمات النانوية لللقاحات التي تتطلب عرض الإبإبيلة الانتهازية

يمكن استخدام الجسيمات النانوية البروتينية ذاتية التجميع، أو SAPNs، لتطوير لقاحات ضد الأمراض المعدية المختلفة. يمكن استخدام هذه الطريقة التي وصفناها هنا لتنقية، إعادة مضاعفة، وتوصيف SAPNs تحتوي على حزمة سداسية الستة. يمكن لهذه الجسيمات النانوية تقديم مستضدات ثلاثية الميرك في شكل يشبه الأصلي.

مع تعديلات طفيفة، يمكن تطبيق هذه الطريقة على غيرها من الأساليب المبتكرة لقاح SAPN. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون من السهل نقلها إلى الإنتاج على نطاق واسع للتجارب السريرية. لتحلل من حصاد E.coli التعبير عن حزمة ستة الحلزون SAPN، استخدم مسبار مع إخراج سونيكيشن من 150 واط مع أربع ثوان من sonication وست ثوان من الراحة، ل sonicate الكريات البكتيرية resuspended في 40 ملليلتر من العازلة إيميدازول خالية على الجليد لمدة خمس دقائق.

الطرد المركزي الخلوية لتوليد sunatant أوضح ونقل فائقة إلى قارورة عقيمة 150 ملليلتر. ثم، إحضار العينة تصل إلى حجم النهائي من 100 ملليلتر مع عازلة خالية من imidazole جديدة. لعزل البروتين من الفائدة، افتح برنامج FPLC وانقر فوق الخيار طريقة جديدة.

في القائمة إعدادات الأسلوب، افتح القائمة المنسدلة موضع العمود وحدد منفذ C1 3. في القائمة المنسدلة "إظهار بواسطة التقنية"، حدد التقارب. في القائمة المنسدلة نوع العمود، حدد الآخرين، HisTrap HP، وخمسة ملليلترات.

سيتم تعيين حجم العمود ومربع الضغط تلقائياً إلى القيم المناسبة. انقر فوق مخطط الأسلوب واسحب أزرار "الإكسال" و"تطبيق العينة" وأزرار "غسل الأعمدة" الثلاثة وزر Elution من القائمة المنبثقة "مكتبة المرحلة" بجوار السهم قبل إغلاق القائمة "مكتبة المرحلة". انقر فوق "توازن" وتعيين القيم المسرودة في الجدول إلى "المخزن المؤقت الأولي" B، 4٪ المخزن المؤقت النهائي B، 4٪ و وحدة تخزين الأعمدة، خمسة.

انقر فوق نموذج التطبيق. في المربع تحميل العينة، انقر فوق الزر الخيار لحقن عينة على عمود مع مضخة العينة، وتأكد من أن المربع الموجود بجوار معدل تدفق الاستخدام من إعدادات الأسلوب يتم تحديد في المربع حقن العينة باستخدام مضخة النظام. تغيير قيمة مربع وحدة التخزين إلى 100 ملليلتر، ونظام مجموعة الكسور إلى تمكين.

Unclick استخدام حجم الكسور من إعدادات الأسلوب مربع ثم تغيير حجم الكسر إلى أربعة ملليلتر. انقر على زر غسل العمود الأول، تعيين القيم المدرجة في الجدول إلى المؤقت الأولي B، 4٪ المخزن المؤقت النهائي B، 4٪ وحجم العمود، 10. انقر فوق مربع تمكين نظام مجموعة الكسور ثم unclick ضغط استخدام حجم الكسر من إعدادات الأسلوب.

تغيير حجم الكسر إلى أربعة ملليلتر، وانقر فوق الزر "غسل العمود" الثاني. تعيين القيم في الجدول إلى "المخزن المؤقت" الأولي B، 0٪ المخزن المؤقت النهائي B، 0٪ و وحدة تخزين الأعمدة، خمسة. انقر فوق مربع تمكين نظام مجموعة الكسور ثم unclick ضغط استخدام حجم الكسر من إعدادات الأسلوب.

تغيير حجم الكسر إلى أربعة ملليلتر ثم انقر فوق الزر "غسل العمود" الثالث. تعيين القيم في الجدول إلى "المخزن المؤقت" الأولي B، 0٪ المخزن المؤقت النهائي B، 0٪ وحدة تخزين الأعمدة، 10. انقر فوق الزر تمكين نظام مجموعة الكسور ثم unclick ضغط استخدام حجم الكسر من إعدادات الأسلوب مربع.

ثم قم بتغيير حجم الكسر إلى أربعة ملليلتر. انقر فوق الزر Elution وانقر بزر الماوس الأيمن فوق المعلومات في الجدول. في القائمة المنبثقة، انقر فوق حذف الخطوة واسحب الزر التدرج متساوي الراسمي إلى الجدول مرتين، بحيث يكون هناك إدخالين.

تعيين قيمة الإدخال الأول إلى "المخزن المؤقت الأولي" B، 30٪ المخزن المؤقت النهائي B، 30٪ و وحدة تخزين الأعمدة، 10. تعيين قيمة الإدخال الثاني إلى B المخزن المؤقت الأولي، 100٪ المخزن المؤقت النهائي B، 100٪ و وحدة تخزين الأعمدة، 10. انقر فوق الزر تمكين نظام مجموعة الكسور ثم انقر فوق المربع استخدام حجم الكسر من إعدادات الأسلوب.

ثم انقر فوق حفظ باسم وتسمية تنقية الملف. ضع المضخة A أنابيب FPLC في عازلة الغسيل الخالية من imidazole ، والمضخة B أنابيب في العازلة إيميدازول 500 ملليمولار. ضع أنابيب مضخة العينة في عينة 100 ملليلتر وادير برنامج التنقية.

عندما يكون هناك حاجة إلى 60٪ غسل isopropanol، وقفة البرنامج، ونقل مضخة أنابيب من غسل imidazole خالية في غسل isopropanol 60٪، وإعادة تشغيل البرنامج. في نهاية الغسيل، وقفة البرنامج مرة أخرى، والعودة إلى أنابيب مضخة A إلى العازلة غسل imidazole خالية، وإعادة تشغيل برنامج تنقية. لتقييم نقاء البروتين النقي ، قم أولاً بدمج الكسور من التدفق ، وغسل واحد ، وغسل اثنين ، وغسل ثلاث خطوات ، في أنابيب مخروطية فردية 50 ملليلتر.

المقبل, مزيج 15 ميكرولترات من كل أنبوب عينة مع 15 ميكرولترات من 2X Laemmli العازلة في أنابيب الفردية 0.5 ملليلتر microcentrifuge وdenature العينات في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. في نهاية الحضانة، اقامة هلام تشغيل الجهاز مع ثلاثة وصمة عار خالية من أربعة إلى 20٪ precast polyacrylamide المواد الهلاميد في Tris-Glycine SDS-PAGE تشغيل المخزن المؤقت. تحميل ثمانية ميكرولترات من علامة الوزن الجزيئي إلى البئر الأولى من كل هلام و 30 ميكرولترات من عينة التشويه إلى الآبار الأخرى.

تشغيل المواد الهلامية في 200 فولت حتى الجبهة صبغ يضرب الجزء السفلي من هلام وشطف لفترة وجيزة المواد الهلامية مع المياه غير المؤينة قبل التصوير على الفور مع نظام التصوير خالية من وصمة عار. ثم، تحديد الكسور التي تحتوي على نطاقات البروتين مع الحجم الصحيح وتجمع هذه الكسور. لمدة ستة الحلزون حزمة SAPN إعادة التكتل، إضافة 10 إلى 20 ملليلتر من البروتين المجمع إلى 10 كيلودالتون الجزيئية الوزن قطع غسيل الكلى كاسيت.

Dialyze كاسيت في ثمانية اليوريا الضرس, 20-ملليمولار تريس, 5٪ الجلسرين, وخمسة ملليمتر TCEP في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، تقليل تركيز اليوريا في عازلة غسيل الكلى متدرجة من قبل اثنين من الضرس كل ساعتين لـ تزد ببطء اليوريا قبالة العينة. عندما يصل تركيز اليوريا إلى اثنين من الضرس ، فانقل جهاز غسيل الكلى إلى أربع درجات مئوية واتى العينة إلى 120 ملليمولار يوريا ، وتريات 20 ملليمولار ، و 5 ٪ من الجلسرين بين عشية وضحاها لإنهاء إعادة الدمج.

في صباح اليوم التالي، قم بإزالة البروتين الذي أعيد طيه من الكاسيت وتصفية حزمة الستة الحلزونية SAPN من خلال فلتر حقنة فلوريد فلوريد 0.22 ميكرومتر. لقياس حجم الجسيمات المتوسطة من حزمة ستة الحلزون SAPN، إضافة 45 ميكرولترات من حزمة ستة الحلزون SAPN إلى cuvette المتاح ووضع cuvette في آلة DLS. بعد ذلك، إنشاء ملف قياس جديد وتشغيل إجراء التشغيل القياسية المكتوبة مسبقا للبروتين في 120 ملليمولار يوريا، 20 ملليمولار تريس، و 5٪ عازلة الجلسرين في 25 درجة مئوية.

ثم، بدء القياس. سيتم حساب حجم متوسط Z PDI ونتائج التوزيع لكل تشغيل. الآلة ستقرأ العينة خمس مرات

بنيت هذه حزمة ستة الحلزون تجميعها بالكامل SAPN على تسلسل البروتين التي من المتوقع أن أضعاف في الجسيمات التي تحتوي على 60 نسخة من مونومر. تم استخدام الخلية الإجمالية لتنقية أحادية حزمة ستة حلزونية SAPN بواسطة FPLC باستخدام عمود النيكل ، مما يدل على أن البروتين مُلَح في كل من 150 و 500 ملليمولار إيميدازول. كما يُظهر الكروماتوغرام قمتين أخريين عند 185 و210 ملليلترات إجمالي حجم مقابل غسل الأيزوبروبانول والغسيل الخالي من الإيميدازول على التوالي.

ويمكن تحديد الكسور ونقاء البروتين المؤتلف من قبل التدرج SDS-PAGE المواد الهلامية مع البروتين من الفائدة تقع أساسا في جزء 68 إلى 79. أشار تحليل البقعة الغربية مع الأجسام المضادة المضادة له ومكافحة 167D4 إلى أن الكسور المجمعة كانت في الواقع البروتين من الفائدة. كما أظهرت البقع وجود حزمة ستة الحلزونات SAPN multimers.

تم طي العينات التي تحتوي على مونومرات البروتين ذات الأهمية في حزمة الستة الحلزونات المجمعة بالكامل SAPN عن طريق غسيل الكلى وتم تحديد توزيع حجم الجسيمات من قبل تحليل تتبع DLS والجسيمات النانوية. كشف التصور عن طريق المجهر الإلكتروني انتقال شكلت بشكل جيد الفردية ستة الحلزون حزمة الجسيمات SAPN مع توزيع الحجم التي تم الحصول عليها من تقنيات التحجيم الجسيمات اثنين. الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو إعادة إليها حزمة ستة الحلزون SAPN.

إن درجة الـ PH و القوة الأيونية الصحيحة للمخزن المؤقت لإعادة التكفّل أمران أساسيان. باستخدام غسل الأيزوبروبانول أثناء التنقية، تمكنا من تقليل LPS الملوثة إلى مستوى منخفض للغاية. ومع ذلك، يمكن تقليل LPS أكثر باستخدام عمود تبادل أنيون حسب الضرورة.

هذه التكنولوجيا يمكن تكييفها بسهولة للتطبيق البشري. وقد تم بالفعل توسيع نطاق SAPN البكتيرية التي تم التعبير عنها من أجل المرحلة القادمة 1/2a الملاريا التجارب السريرية.