توطين والقياس الكمي لفيروسات البيجومو في أنسجة الذبابة البيضاء عن طريق الفلورة المناعية وPCR الكمي
February 8th, 2020
نحن نصف الفلور المناعي وطريقة PCR الكمية لتوطين والقياس الكمي لفيروسات البجومو في أنسجة الحشرات. يمكن استخدام بروتوكول الفلورسينس المناعي لتوطين البروتينات الفيروسية والنواقل. ويمكن توسيع نطاق بروتوكول PCR الكمي لتحديد الفيروسات في أجسام الذبابة البيضاء الكاملة والنباتات المصابة بالفيروس.
ويمكن أن يساعد توضيح المكانية وكمية الفيروس في ناقلات الحمى البيضاء في فهم التفاعلات البيرغوموفيروس وايتفل وفي وضع استراتيجيات جديدة للسيطرة على الأمراض الخطيرة البغوموفيروسية. مزايا هذه التقنية هي أننا يمكن أن نعزل بسرعة أنسجة الفلعة البيضاء ، والمشاركة في توطين البروتينات الفيروسية والفلعة البيضاء ، وقياس الفيروسات في الأجسام البيضاء بأكملها والنباتات المصابة بالفيروسات. في الوقت المناسب في وقت تجريبي، بعد اكتساب الفيروس، ضع الذباب الأبيض الأنثوي المُجَبَّر في قطرة من برنامج تلفزيوني على شريحة مجهر واستخدم إبرة الوخز بالإبر الدقيقة لفتح بطن الذباب الأبيض تحت مجهر ستيريو.
استخدام إبرة لاستخراج midgut ووضع منتصف في طبق جمع من برنامج تلفزيوني. لجمع PSGs، وتقسيم الجسم في الصدر من الجانب الظهري بالقرب من الرأس وإصلاحرفل الأبيض مع إبرة من خلال الصدر. استخدام إبرة ثانية لهزة الفلات حتى يتم فصل الغدد اللعابية اثنين من الجسم ونقل الغدد إلى طبق جديد من برنامج تلفزيوني.
لجمع المبيضين، افتح البطن تمامًا واستخدم إبرة لفصل المبيضين عن الأنسجة الأخرى. استخدام ماصة لإزالة الأنسجة الزائدة ونقل المبيضين إلى طبق جديد من برنامج تلفزيوني. لجمع عينة من الهيموليم، إضافة 10 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني على شريحة مجهر جديدة ووضعرففلي جديد في قطرات.
استخدم إبرة الوخز بالإبر الدقيقة لإحداث ثقب في البطن. ثم تطبيق ضغط طفيف على البطن للافراج عن الهيمولى في المخزن المؤقت وجمع عينة من السائل ثمانية ميكرولتر. لتصور توطين TYLCV في حصادها whitefly PSG، midgut، أو أنسجة المبيض، ونقل 15 إلى 20 عينات في كوب 3.5 سم طبق بيتري وpirpirate العازلة الزائدة.
إصلاح الأنسجة في ملليلتر واحد من 4٪ شبهformaldehyde لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة قبل غسل العينات بعناية ثلاث مرات لمدة دقيقتين في ملليلتر واحد من TBS الطازجة في الغسيل. بعد الغسيل الأخير، Permeabilize عينات مع ملليلتر واحد من 0.5٪ تريتون X-100 لمدة 30 دقيقة قبل غسل ثلاث مرات كما أظهرت فقط مع ملليلتر واحد من TBST في غسل. بعد الغسيل الأخير، كتلة أي ربط غير محددة مع ملليلتر واحد من 1٪ البوم مصل البقر لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة تليها ثلاثة يغسل في TBST كما هو موضح.
بعد الغسيل الأخير، قم بتسمية الخلايا بالأجسام المضادة الأولية ذات الأهمية بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية محمية من الضوء. في صباح اليوم التالي، قم بغسل العينات ثلاث مرات باستخدام TBST قبل إضافة الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء. في نهاية الحضانة، وغسل midguts ثلاث مرات ونقل العينات إلى شريحة المجهر نظيفة.
إزالة أكبر قدر ممكن من العازلة وصمة عار النوى مع قطرة واحدة من DAPI قبل تركيب مع غطاء وفحص الأنسجة المسماة عن طريق المجهر confocal. بالنسبة لتكميم TYLCV ، قم بغسل عينات أنسجة الفلعة البيضاء المقطوعة مرتين إلى ثلاث مرات في PBS جديدة ونقل 20 midguts ، 20 PSGs ، أو مبيض واحد في خمسة ميكرولترات من PBS إلى أنابيب PCR الفردية التي تحتوي على 25 ميكرولترات من محلول التحلل. إضافة خمسة إلى سبعة اثنين من الخرز السيراميك ملليمتر قطرها إلى كل أنبوب وطحن العينات في التجانس.
إضافة عينة واحدة ثمانية ميكرولتر من الهيموليتف في أنبوب PCR جديد وإضافة 10 ميكرولترات من التحلل إلى الأنبوب مع خلط شامل. احتضان جميع العينات في 65 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة تليها حضانة لمدة 10 دقيقة في 100 درجة مئوية وطرد المركزية وجيزة. بعد ذلك، أضف 18 ميكرولترات من المزيج الرئيسي في قوارير أنابيب قطاع PCR الكمية وإضافة اثنين من ميكرولترات من كل عينة الحمض النووي إلى ثلاث قوارير على الأقل.
عندما يتم تحميل جميع العينات، أغلق الأنابيب والطرد المركزي إلى الرواسب الحل في الجزء السفلي من كل قارورة. تحميل قارورة على دورة الحرارية في الوقت الحقيقي لPCR الكمية، واختيار الانترنت وصبغة الفلوروفور وغير معروف كنوع العينة. ثم تصدير البيانات الكمية إلى جدول بيانات لتحليل الكمية النسبية من الحمض النووي الفيروسي في كل عينة.
هنا، يتم عرض صور تمثيلية من TYLCV في DAPI تلطيخ في PSGs اللافرف الأبيض، midguts، والمبايض. كما لوحظ، TVLCV يدل على تراكم أكبر داخل PSGs و midguts مما كانت عليه في المبيضين. يشير القياس الكمي للفيروس في PSGs، منتصف السجائر، الهيملmph، والمبايض بعد التغذية على الطماطم المصابة TYLCV لمدة 24 و 48 و 72 ساعة إلى أن كمية الفيروس تزيد في أنسجةرفيل بيضاء مختلفة في ارتباط مباشر مع الزيادة في فترة الوصول إلى الاكتساب.
فمن الأفضل لاستخدام الذباب الأبيض الطازج ، والحشرات الميتة سوف تزيد من صعوبة تشريح. بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء تحليلات أخرى، مثل النشاف الغربي والمشارك في المناعة، للإجابة على أسئلة إضافية حول التعبير البروتين الفيروسي والتفاعلات الفيروسية والبروتين المتجه.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة لتحديد المواقع وتقدير عدد البغموفيرات في ناقلات الذبابة البيضاء باستخدام التألق المناعي الكمي وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي. يمكن أن يساعد فهم المكانية والكمية لهذه الفيروسات في تطوير استراتيجيات السيطرة على الأمراض البغموفيرية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الفيروسات
- علم الحشرات
- البيولوجيا الجزيئية
الخلفية
- البغموفيرات هي مسببات الأمراض الهامة التي تؤثر على النباتات.
- تعمل الذبابات البيضاء كنواقل لهذه الفيروسات.
- فهم تفاعلات الفيروس-الناقل ضروري لإدارة المرض.
- الطرق الحالية لدراسة هذه التفاعلات محدودة.
هدف الدراسة
- تطوير تقنية لعزل وتقدير البغموفيرات في أنسجة الذبابة البيضاء.
- تحديد مواقع البروتينات الفيروسية والناقلة بشكل مشترك.
- توسيع طرق التقدير لتشمل أجسام الذبابات البيضاء الكاملة والنباتات المصابة بالفيروس.
الطرق المستخدمة
- التألق المناعي لتحديد مواقع البروتينات.
- تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي لتقدير الفيروسات.
- عزل أنسجة الذبابة البيضاء باستخدام إبر الوخز بالإبر الدقيقة.
- الفحص المجهري للأنسجة المستخرجة.
النتائج الرئيسية
- تحديد مواقع البغموفيرات بنجاح في أنسجة الذبابة البيضاء.
- تقدير الفيروسات في أجسام الذبابة البيضاء الكاملة.
- تحقق تحديد المواقع المشتركة للبروتين الفيروسي وبروتينات الذبابة البيضاء.
- طريقة قابلة للتطبيق على النباتات المصابة بالفيروس.
الاستنتاجات
- تعزز الطرق المتقدمة فهم تفاعلات البغموفيرات والذبابة البيضاء.
- يمكن أن تفيد هذه التقنيات في استراتيجيات التحكم في الأمراض البغموفيرية.
- يمكن للبحوث المستقبلية البناء على هذه الطرق لتطبيقات أوسع.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Understanding virus-vector interactions is critical for developing targeted interventions against plant pathogens that threaten global crop yields. This method enables precise spatial and quantitative analysis of begomoviruses in whitefly tissues, supporting mechanistic de-risking in early-stage antiviral or vector control target validation. By providing reproducible localization and quantification data, it enhances predictive confidence in target selection and pathway interrogation for agrochemical or biologics discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of viral tissue tropism and vector protein interactions to clarify mechanistic hypotheses.
- Operational Value: Provides standardized tissue dissection and labeling workflows for consistent target engagement assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative viral load data across tissues to support assay readout standardization and reproducibility.
- Operational Value: Establishes a scalable sample preparation pipeline for high-throughput screening of antiviral compounds or vector-targeting agents.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by enabling correlation of viral accumulation with transmission potential.
- Operational Value: Facilitates cross-functional alignment between virology, entomology, and molecular biology teams through standardized outputs.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization by providing tissue-specific viral quantification and co-localization data that inform target selection and mechanism of action studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of viral protein function and vector interaction pathways through direct tissue localization.
- Screening: Enables assay readiness by providing quantified viral DNA inputs for compound efficacy screening in vector-based models.
- Analytics: Delivers quantitative PCR readouts that allow statistical comparison of viral burden across experimental conditions and time points.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical relevance by enabling viral load correlation with transmission efficiency in whitefly populations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue processing and detection platform applicable to multiple virus-vector systems beyond begomoviruses.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in virus-vector interaction models through direct tissue-level visualization and quantification.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized tissue isolation, fixation, and detection protocols across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in target validation by providing quantitative thresholds for viral accumulation in key tissues.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antiviral or vector control strategies based on tissue-specific viral dynamics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in insect dissection, immunofluorescence microscopy, and qPCR assay design.
- Dependent on access to confocal microscopes, thermal cyclers, and tissue homogenization equipment.
- Necessitates cross-team standardization of tissue collection timing and fixation procedures.
- Adaptation to other vector systems may require optimization of antibody penetration and tissue permeability steps.
- Practical limitations include tissue degradation risk with delayed processing and variability in whitefly infection efficiency.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:43
Female Whitefly Midgut, Primary Salivary Gland (PSG), Ovary, and Hemolymph Dissection
2:03
Tomato Yellow Leaf Curl Virus (TYLCV) Localization
3:40
TYLCV Quantification
5:04
Results: Representative TYLCV Detection and Quantification
5:46
Conclusion
