قياس التفاعلات عبر الخلية من خلال تجميع البروتين في نظام الخلايا heterologous

يسمح الاختبار القائم على الخلية بمراقبة وقياس تفاعلات الالتصاق العابرة دون الحاجة إلى تنقية طويلة للبروتين أو معدات متخصصة. على الرغم من أن تفاعلات البروتين التي تم اختبارها هنا ذات صلة بعلم الأعصاب ، إلا أنه يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي مجال من مجالات البحث حيث يحدث التصاق البروتين بين الخلايا. بعد 48 ساعة من نقل خلايا HEK-293T ، قم بحصاد الخلايا من الصفيحة المكونة من ستة آبار للتجميع.

أولا ، اغسل كل بئر مرتين باستخدام PBS. بعد ذلك ، لفصل الخلايا برفق ، أضف ملليلترا واحدا من 10 ملليمولار EDTA إلى كل بئر ، ثم احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية. بعد خمس دقائق من الحضانة ، اضغط برفق على اللوحة لفصل الخلايا وحصاد كل بئر في أنبوب مخروطي منفصل سعة 15 مل.

الطرد المركزي الأنابيب عند 500 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. أثناء تكوير الخلايا ، قم بإعداد ستة أنابيب حضانة عن طريق وضع العلامات على قمم أنابيب الطرد المركزي الدقيقة بالظروف التجريبية. يجب استخدام كل تبديل من GFP و mCherry .

قم بإزالة المادة الطافية من الأنابيب المخروطية سعة 15 مليلتر وأعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من المتوسط. باستخدام مقياس كثافة الدم ، عد الخلايا في كل أنبوب مخروطي. ثم قم بنقل 200 ، 000 خلية من كل حالة إلى أنبوب الحضانة المناسب لمزيج واحد لواحد بحجم إجمالي يبلغ 500 ميكرولتر.

بعد تقييم التجميع الأساسي الموصوف في القسم التالي ، ضع أنابيب الحضانة في دوار أنبوب بطيء في درجة حرارة الغرفة. لتقييم التجميع ، عند خط الأساس ومرة أخرى بعد 60 دقيقة ، قم بإدخال 40 ميكرولتر من أنبوب الحضانة على شريحة مجهر مشحونة. يجب أن يتم اكتساب خط الأساس في أسرع وقت ممكن بعد إضافة الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق.

قم بتصوير الشريحة تحت التألق في كل من القناتين الخضراء والحمراء. لكل شريحة، التقط صورا لثلاثة مجالات رؤية مختلفة في مستوى بؤري واحد. تم نقل خلايا HEK-293T ببروتين مثير للاهتمام ، أو بروتين متحور ذي أهمية ، أو رابط ذي أهمية وشاركت مع بروتين فلورسنت.

تم خلط مجموعات الخلايا التي تعبر عن البروتين محل الاهتمام مع مجموعات الخلايا التي تعبر عن الترابط محل الاهتمام وتقييمها للتجميع بعد 60 دقيقة. في تراكبات الصور الملتقطة في القناتين الخضراء والحمراء ، يظهر التجميع على شكل نقطة صفراء. أظهرت الظروف التي لم تعبر فيها الخلايا عن أي روابط متشابكة الحد الأدنى من التجميع.

أيضا ، تم عرض الحد الأدنى من التجميع عندما كان واحد فقط من المجموعتين يعبر عن روابط متشابكة. لم يظهر أي تجميع عندما عبرت مجموعتان من الخلايا عن جزيئات التصاق غير متوافقة. أظهرت الظروف ذات جزيئات الالتصاق المتوافقة تراكما كبيرا بعد حضانة لمدة 60 دقيقة.

والمثير للدهشة أن البروتين المتحور المعني أظهر تجميعا أكبر بكثير من نظيره من النوع البري ، مما يشير إلى أن الطفرة النقطية تعزز قدرات ربط البروتينات. ترتبط الطفرات في العديد من جزيئات الالتصاق عادة باضطرابات النمو العصبي والعصبي والنفسي والإدمان. باستخدام هذه التقنية ، يمكن للمرء فحص آثار الطفرات النقطية ذات الصلة بالمرض على التفاعلات المتحولة.