Name: قياس التفاعلات عبر الخلية من خلال تجميع البروتين في نظام الخلايا heterologous (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 47 s
Description: اكتشف بروتوكولًا محسّنًا لقياس تفاعلات البروتين عبر الخلية بسرعة باستخدام مجهر الفلورسنس في خلايا HEK-293T. تُمكّن هذه الطريقة الباحثين من دراسة التصاق البروتينات في علم الأعصاب والمجالات البيولوجية الأخرى.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وقد تم دعم هذا العمل من قبل المنح من المعهد الوطني للصحة العقلية (R00MH103531 و R01MH116901 إلى J.A.) ، ومنحة تدريب ما قبل الدكتوراه من المعهد الوطني للطب العام (T32GM007635 إلى S.R.) ، وزمالات ليدا هيل جيليام للدراسة المتقدمة (GT11021 إلى S.R.). نشكر الدكتور كيفن وولفري على المساعدة في المجهر، والدكتور ك أولريش باير لاستخدام مجهره النيففلورسنت، وتوماس سودهوف (جامعة ستانفورد) لLRRTM2 بلاسميد.

1. خلية ثقافة وtransfection
<ol><li>جعل وسائط الخلية HEK مع DMEM، 1x (تعديل دولبيككو من المتوسط النسر) تكملها مع 4.5 ز / ل الجلوكوز، L-الجلوتامين والصوديوم بيروفات و 10٪ FBS. مرشح معقمة.</li>
	<li>يحدد مسبقاً الأحرف اللينة والمستقبلات المناسبة لتشايس التجميع. ملاحظة: Neurexin3α SS4+/ - وأحد اليغانات المعروفة، LRRTM2، تم استخدامه في هذه الدراسة. وأعرب عن اليغاندس والمستقبلات من الفائدة من cDNAs في pcDNA3.1. تم استخدام تجميع جيبسون لإدراج Neurexin3α فيpcDNA3.12. Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGGCGCATCCCACCATGAGCCTCTCTCACCTCACCCACTC/ GAGCGGCCGCCACTGCTGCTGCTGGGGGGGGGGACCTTACACATAATAATACTCCTTCCTT.</li>
	<li>إعداد خلايا HEK293T.<ol>
<li>تنمو خلايا HEK293T إلى التقاء في واحدة T-75 قارورة.</li>
		<li>مرة واحدة التقاء، واستخدام 2 مل من التربسين ومكان في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. إضافة 6 مل من وسائط HEK إلى القارورة لإعادة تعليق الخلايا ونقل جميع 8 مل إلى أنبوب مخروطي 15 مل.</li>
		<li>بيليه في 500 س ز لمدة 5 دقائق و resuspend في وسائط الخلية HEK لمجموع 8 مل.</li>
		<li>عد الخلايا وإضافة 735،000 الخلايا في كل بئر من لوحة 6-جيدا. ضبط مستوى الصوت النهائي إلى 2 مل لكل بئر باستخدام وسائط خلية HEK.</li>
		<li>وضع في حاضنة 37 درجة مئوية والسماح للخلايا أن تنمو بين عشية وضحاها أو حتى تصل إلى 50-60٪ التقاء.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfect خلايا HEK293T باستخدام طريقة فوسفات الكالسيوم13.<ol>
<li>Transfect جيدا-1 مع 3 ميكروغرام من البروتين من الفائدة وtransfect مع 1 ميكروغرام من البروتين الفلورسنت (3 ميكروغرام من pcDNA3.1-Neurexin3αWT SS4- و 1 ميكروغرام من mCherry).</li>
		<li>Transfect بشكل جيد-2 كما في الخطوة 1.4.1. ولكن مع البروتين المتحول من الفائدة (pcDNA3.1-Neurexin3αA687T SS4-).</li>
		<li>Transfect جيدا-3 مع 3 ميكروغرام من يغاند من الفائدة وtransfect مع 1 ميكروغرام من بروتين آخر الفلورسنت (3 ميكروغرام من pcDNA3.1 LRRTM2 و 1 ميكروغرام من GFP).</li>
		<li>Transfect جيدا-4 و-5 لتكون بمثابة ضوابط سلبية: جيدا-4 مع 1 ميكروغرام من GFP و-5 جيدا مع 1 ميكروغرام من mCherry.</li>
		<li>إعداد لوحة أخرى (كما هو الحال في الخطوة 1.4.1-1.4.4) إذا تطلبت شروطًا أو عناصر تحكم إضافية (Neurexin3αWT/A687T SS4+). ملاحظة: يتم تحليل كفاءة النقل 24 ساعة بعد transfection تحت مجهر epifluorescence وكميتها كعدد من الخلايا التي تعبر عن البروتين الفلورسنت أنها كانت مصابة. ومن شأن اتباع نهج أكثر تبسيطا أن يشمل نقل خلايا HEK مع ترميز ناقلات bicistronic لبروتين الفلورسنت ورابطة الاهتمام وينصح بشدة فوق co-transfection. في حالة هذه الدراسة، ألفا Neurexins هي ~ 4.3 كيلوبايت، ولوحظت كثافة الفلوريسنس منخفضة باستخدام نظام bicistronic مما يستلزم co-transfection.</li>
	</ol></li>
	<li>بعد 48 ساعة من عملية التهيّن، حصاد الخلايا من أجل التجميع.<ol>
<li>غسل كل جيدا مرتين مع برنامج تلفزيوني.</li>
		<li>أضف 1 مل من 10 mM EDTA في برنامج تلفزيوني في كل بئر إلى فصل بلطف التفاعلات بين الخلايا إلى الخلية ولوحة احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ملاحظة: لا ينصح التربسين للخطوة 1.5.2 بسبب الانقسام البروتيني المحتمل لجزيئات التصاق في الدراسة. بالإضافة إلى ذلك، بعد إضافة EDTA قد لا يتم إيقاف البروتوكول حتى اكتمال كما الخلايا الآن سيتم تعرضها للظروف المحيطة.</li>
		<li>بلطف اضغط لوحة لفصل الخلايا، وحصاد كل بئر في أنابيب مخروطية 15 مل منفصلة.</li>
		<li>أنابيب مخروطية للطرد المركزي عند 500 x g ودرجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.</li>
	</ol></li>
	<li>في حين أن الخلايا هي تعبئة، وإعداد 6 أنابيب الحضانة عن طريق وضع العلامات على الجزء العلوي من كل أنبوب microcentrifuge مع كل حالة. ملاحظة: ينبغي استخدام كل تبديل في شروط GFP و mCherry لتشمل جميع الظروف التجريبية والضوابط المناسبة. على سبيل المثال: 1. GFP/mCherry، 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3αWT SS4--mCherry, 4. GFP/Neurexin3αA687T SS4- mCherry, 5. Neurexin3αWT SS4----mCherry/LRRTM2-GFP, 6. Neurexin3αA687T SS4- -mCherry/LRRTM2-GFP. جعل أنابيب إضافية لاستيعاب المزيد من الشروط والضوابط.</li>
	<li>إزالة الخلايا فائقة و resuspend في 500 ميكرولتر من وسائط HEK مع 10 mM CaCl2 و 10 mM MgCl2 2 الدفء إلى 37 درجة مئوية. ملاحظة: إضافة CaCl2 و MgCl2 يسمح جزيئات التصاق لإعادة الربط وهو مطلوب فقط إذا كان الشركاء التفاعل عبر الخلية في السؤال تتطلب الكاتيونات divalent للتصاق.</li>
	<li>عد الخلايا في كل أنبوب مخروطي 15 مل باستخدام مقياس للهيمويت و aliquot 200,000 خلية من كل حالة في أنبوب مناسب من الخطوة 1.6.1 لمزيج 1:1 في حجم إجمالي 500 ميكرولتر. ملاحظة: يجب أن يستغرق 5 دقائق فقط لكل شرط لحساب والمبالغ aliquot.</li>
	<li>احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة في دوار أنبوب بطيء.</li>
</ol>2. الحصول على صورة
<ol><li>تحسين المعلمات المجهر للحصول على عينات محددة. في هذا المثال، تم التقاط الصور على مجهر واسع المجال. استخدام هدف الهواء 5x (NA: 0.15; WD: 20000 μm) للحصول على حقل كبير بما فيه الكفاية للتحليل.</li>
	<li>تقييم تجميع خط الأساس مباشرة بعد خلط الشرطين خلايا HEK في الخطوة 1.8. هذه هي الآن 'الوقت صفر' الصور.<ol>
<li>Pipette 40 ميكرولتر من كل خليط عينة على شريحة المجهر المشحونة والصورة تحت الفلورانس في كل من القنوات 488 و 561.</li>
		<li>الحصول على ثلاثة حقول مختلفة من الرؤية في مستوى التركيز واحد لكل قطرة العينة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>الحصول على الصور النهائية في 60 دقيقة كما صورة 'الوقت 60'.<ol>
<li>للحصول على صورة 'الوقت 60' من الخليط بعد 60 دقيقة حضانة، واتخاذ آخر 40 ميكرولتر عينة من كل حالة من أنابيب الدورية والماصات كل عينة على شريحة مشحونة. صورة كما في الخطوة 2.2.2. ملاحظة: يجب التحقق من تجميع الخلايا كل 15 دقيقة حتى يحدث التشبع. وسيتوقف توقيت التجميع على البروتينات التي يجري اختبارها.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. تحليل ImageJ/فيجي
<ol><li>لتحديد مدى التجميع باستخدام فيجي/ImageJ، احفظ ملفات التحليل.<ol>
<li>حفظ ملفات ترميز إضافية المتوفرة في مجلد imageJ وحدات الماكرو على الكمبيوتر.</li>
		<li>تثبيت ماكرو التجميع المتوفرة (الإضافات، وحدات الماكرو، تثبيت، وحدد ملف "AggregationAssay.txt").</li>
	</ol>
</li>
	<li>تحديد العتبات.<ol>
<li>تحميل ملف "وقت الصفر" .tif إلى imageJ وتقسيم القنوات (صورة | | اللون انقسام القنوات). ملاحظة: يتم استخدام الصورة 'الوقت صفر' لتحديد العتبة وأصغر حجم بونكتا للتجربة بأكملها.</li>
		<li>قناع كل قناة(الإضافات | | وحدات الماكرو AggregationAssay_MakeMask). جعل قناع من صورة نافذة سوف تظهر. خانات الاختيار بجوار تحديد عتبة الصورة وتحديد الكتل Params من مدرج التكراري وانقر فوق موافق.</li>
		<li>حدد عتبة الصورة باستخدام شريط الشرائح، وسجل الرقم إلى يمين شريط الشرائح، وانقر فوق موافق.</li>
		<li>سيظهر مدرج بياني لحجم الكتلة. حدد حجم كتلة من الرسم البياني الذي يناسب التجربة، اكتب هذا الرقم في المربع الحد الأدنى من حجم الكتلة: ثم انقر فوق موافق. لن يتم تحليل الكتل التي دون هذا الحجم.</li>
	</ol>
</li>
	<li>قم بتشغيل التحليل.<ol>
<li>فتح صورة 'الوقت 60' من حالة 1 في imageJ وتقسيم القنوات كما هو الحال في الخطوة 3.2.1.</li>
		<li>قناع كل قناة (الإضافات ، وحدات الماكرو ، AggregationAssay_MakeMask). استخدام نفس عتبة والحجم المحدد في الخطوة 3.2.3 والخطوة 3.2.4. إلغاء تحديد المربعات بجوار تحديد عتبة الصورة وتحديد الكتل Params من الرسم البياني ثم يدوياً اكتب الحجم وعتبات في الحقول المناسبة ثم انقر فوق موافق.</li>
		<li>حساب مؤشر التجميع(الإضافات | | وحدات الماكرو AggregationAssay_CalculateOverlap). حدد القنوات المقنعة التي سيتم مقارنتها والدليل الذي سيتم حفظ الملفات الناتجة فيه.</li>
		<li>كرر الخطوات 3.3.1-3.3.3 لكل صورة 'الوقت 60' في كل حالة. ملاحظة: يُعرَّف مؤشر التجميع بأنه منطقة التداخل الإجمالي مقسوماً على مجموع منطقتين للقناتين مطروحاً منها منطقة التداخل مضروبة في 100 (مؤشر التجميع = منطقة التداخل/[مساحة القناة 1 + مساحة القناة 2 – منطقة التداخل] x 100). هذا التهيئة عملية 'OR' بين القناتين المقنعين تمثل إجمالي البيكسلات في أي قناع.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li>
<li>Lakey, J. H., Raggett, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring protein-protein interactions.</a> Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).</li>
<li>Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+neurexin-3+alternative+splicing+trans-synaptically+controls+postsynaptic+AMPA+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking.</a> Cell. 154 (1), 75-88 (2013).</li>
<li>Aoto, J., Földy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+circuit-dependent+functions+of+presynaptic+neurexin-3+at+GABAergic+and+glutamatergic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).</li>
<li>Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+Neurexin+Complexes%3A+A+Molecular+Code+for+the+Logic+of+Neural+Circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits.</a> Cell. 171 (4), 745-769 (2017).</li>
<li>Dai, J., Aoto, J., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+Splicing+of+Presynaptic+Neurexins+Differentially+Controls+Postsynaptic+NMDA+and+AMPA+Receptor+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses.</a> Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).</li>
<li>Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+a+Neurexin-3%CE%B1+Human+Mutation+in+Mouse+Neurons+Identifies+a+Novel+Role+in+the+Regulation+of+Transsynaptic+Signaling+and+Neurotransmitter+Release+at+Excitatory+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modeling a Neurexin-3α Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).</li>
<li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li>
<li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li>
<li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li>
<li>Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTMs+and+Neuroligins+Bind+Neurexins+with+a+Differential+Code+to+Cooperate+in+Glutamate+Synapse+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development.</a> Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).</li>
<li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Bacchetti, S., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+the+gene+for+thymidine+kinase+to+thymidine+kinase-deficient+human+cells+by+purified+herpes+simplex+viral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).</li>
<li>Cerchiari, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+tissue+self-organization+that+is+robust+to+cellular+heterogeneity+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).</li>
<li>Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interactions+in+inflammation+and+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Magazine%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).</li>
<li>Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interactions+in+rheumatoid+arthritis+synovium%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatic+Diseases+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium.</a> Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).</li>
<li>Yamagata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+modulation+and+selectivity+of+transsynaptic+neurexin-LRRTM+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction.</a> Nature Communications. 9 (1), 3964(2018).</li>
<li>Nguyen, T., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+properties+of+neuroligin+1+and+neurexin+1beta+reveal+function+as+heterophilic+cell+adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules.</a> The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).</li>
<li>Boucard, A. A., Ko, J., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Affinity+Neurexin+Binding+to+Cell+Adhesion+G-protein-coupled+Receptor+CIRL1%2FLatrophilin-1+Produces+an+Intercellular+Adhesion+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).</li>
</ol>

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

تشريح البروتين البروتينية التفاعلات التي تحدث في عبر خلال التصاق الخلية يمكن أن يؤدي إلى فهم أفضل للآليات الجزيئية الكامنة في العمليات الخلوية الأساسية بما في ذلك تشكيل وظيفة وصيانة نقاط الاشتباك العصبي أثناء النضج وإعادة عرض. الآثار المترتبة على التفاعلات من خلية إلى خلية توسيع نطاقها وراء علم الأعصاب ولها أدوار أوسع نطاقا في نقل الإشارات، وهجرة الخلايا وتطوير الأنسجة14. يمكن الانحرافات في التصاق الخلية تعطيل العمليات الخلوية حتمية لوظيفة الخلية السليمة ويمكن الكامنة تحت مجموعة متنوعة من الإلتكول...

التفاعلات متشابك تسهيلها من قبل جزيئات التصاق متشابك هي الأساس لتطوير وتنظيم ومواصفات وصيانة وظيفة من نقاط الاشتباك العصبي وتوليد الشبكات العصبية. ويتزايد بسرعة تحديد جزيئات التصاق الخلايا المتحولة؛ وبالتالي، من المهم بشكل أساسي تحديد الشركاء الملزمين وفهم كيفية تفاعل جزيئات الالتصاق الجديدة هذه مع بعضها البعض. بالإضافة إلى ذلك، حددت تسلسل الجينوم الطفرات في العديد من هذه الجزيئات التصاق التي ترتبط عادة إلى العديد من الاضطرابات العصبية النمائية، العصبية والنفسية،والإدمان 1. الطفرات في الجينات التي رمز لجزيئات التصاق الخلايا متشابك قد تغير بشكل ضار التفاعلات عبر وقد تسهم في التعديلات فيزيائية المرضية في تشكيل المشبك أو الصيانة.
توجد مقايسات متعددة لتقييم كمي تفاعلات البروتين والبروتين مثل قياس السعرات الحرارية isothermal، dichroism دائري، الرنين البلازمونالسطحي 2 وعلى الرغم من الكمية في الطبيعة، لديهم عدة قيود. أولاً، تتطلب بروتيناً مؤتلفاً، وتطالب أحياناً بخطوات تنقية طويلة ومملة. ثانيا، تتطلب هذه الكفاءات معدات متخصصة متطورة وخبرة فنية. ثالثاً، يمكن أن تبالغ في تقدير مدى الربط لأنها تسمح لكل من رابطة الدول المستقلة والتفاعلات العابرة بين البروتينات المربوطة بشكل طبيعي إلى غشاء في الجسم الحي. هنا نقترح اختبار بسيط وسريع نسبيا أن الاختبارات حصرا التفاعلات عبر.
للتحايل على العديد من المضاعفات المرتبطة بمقايس البروتين النقي، قمنا بتحسين تحليل تفاعل البروتين القائم على الخلايا الذي يلخص التفاعلات عبر في نظام الخلايا غير المغايرة. وقد سبق استخدام هذا الفحص في أشكال مختلفة لدراسة التفاعلات عبر الخلايا. في هذا النهج، يتم نقل جزيئات التصاق الخلية المرشحة إلى خلايا HEK293T. في الظروف الفسيولوجية، خلايا HEK293T لا تظهر التجميع الذاتي، مما يجعلها نماذج مثالية لهذا الفحص. ومع ذلك، عندما يتم الجمع بين مجموعات من الأفراد من خلايا HEK التعبير عن مستقبلات ويغاند، فإن ربط المستقبلات وقواد ليغاند تجميع خلايا HEK أن يحدث. ويتم هذا التجميع حصرياً عن طريق التفاعلات عبر، وعادة ما يكون قابلاً للملاحظة في عشرات الدقائق. لا يلزم اتخاذ خطوات لتنقية البروتين في هذه الطريقة، وتعتمد كفاءة الطريقة على النموذج الذي يتم فيه دمج مجموعات خلايا HEK التي تعبر عن جزيئات التصاقها، ثم يتم تصويرها بعد عشرات الدقائق فقط. بالإضافة إلى ذلك، هذه الطريقة غير مكلفة نسبيا، حيث لا الأجسام المضادة ولا معدات مكلفة مطلوبة. المعدات الوحيدة المطلوبة للحصول على البيانات هي مجهر فلوري قياسي. ميزة إضافية لهذا المقايسة القائمة على الخلية هي القدرة على فحص بسرعة تأثير الطفرات نقطة ذات الصلة المرض على التفاعلات عبر. ويمكن إجراء ذلك عن طريق نقل خلايا HEK مع cDNAs من المتغيرات المتحولة من البروتين من الفائدة.
في هذا البروتوكول، نقدم مثالاً نتحقق فيه مما إذا كانت طفرة الميزنس في Neurexin3α (Neurexin3αA687T)،التي تم تحديدها في مريض تم تشخيصه بإعاقة ذهنية عميقة والصرع، يغير التفاعلات في ترانس مع بروتين تكرار الغشاء اللين الغني باليوسين 2 (LRRTM2). Neurexin3α هو عضو في الأسرة المحفوظة تطوريا من الجزيئات presynaptic الخلية التصاق وبينما عمل مؤخرا قد حددت أدوار متعددة في المشبك3,4,5,6,7, فهمنا متشابك من هذا الجزيء وجميع أعضاء الأسرة neurexin لا تزال غير مكتملة. LRRTM2 هو عبارة عن بروتين التصاق الخلايا بعد التصاقات ما بعد التصاقات التي تشارك في تشكيل المشبك العصبي والصيانة8,9,10. الأهم من ذلك، LRRTM2 يتفاعل حصرا مع isoforms neurexin التي تفتقر إلى موقع لصق 4 exon البديل (SS4-) ولكن ليس مع isoforms neurexin التي تحتوي على موقع لصق 4 البديلة exon (SS4 +). يقع الطفرة البشرية (A687T) التي تم تحديدها في Neurexin3α في منطقة خارج الخلية غير مدروسة يتم حفظها تطورياً ويتم الحفاظ عليها بين جميع نويات ألفا7. كما تم تأسيس التفاعل بين هذين الجزيئات8,9,11, طرحنا السؤال: هل القدرة على الربط من Neurexin3α SS4- إلى LRRTM2 غيرت بواسطة A687T نقطة طفرة؟ وكشفت هذه الأقوال أن طفرة نقطة A687T عززت بشكل غير متوقع تجميع Neurexin3α إلى LRRTM2 مما يشير إلى أن المنطقة خارج الخلية التي تقع فيها الطفرة النقطة، تلعب دورا في التوسط التفاعلات عبرسينابتيك.

<table><tbody><tr><td>1.5 مل أنابيب دقيقة يمكن التخلص منها مع أغطية المفاجئة</td><td>VWR</td><td>89000-028</td><td>حضانة السكان المختلطين من خلايا HEK</td></tr><tr><td>1000 مل Rapid & [مدش] ؛ وحدة تصفية التدفق ، 0.2 um aPES غشاء</td><td>Thermo Fisher</td><td>567-0020</td><td>تعقيم وسائط HEK</td></tr><tr><td>15 مل أنابيب الطرد المركزي SpectraTube</td><td>Ward ' s Science</td><td>470224-998</td><td>حصاد خلايا HEK</td></tr><tr><td>6 ألواح زراعة الأنسجة المعقمة</td> جيدا <td>VWR</td><td>100062-892</td><td>زراعة خلايا HEK</td></tr><tr><td>كلوريد الكالسيوم</td><td>Sigma</td><td>223506-500G</td><td>تعداء فوسفات الكالسيوم ، إعادة تعليق خلية HEK</td></tr><tr><td>أجهزة الطرد المركزي - Sorvall Legend RT</td><td>Kendro منتجات المختبر</td><td>75004377</td><td>حصاد خلايا HEK</td></tr><tr><td>حاضنة</td> <td>خلايا CO2Thermo Scientific</td><td>HERACELL 150i</td><td>حضانة خلايا HEK أثناء النمو</td></tr><tr><td>DMEM ، 1x (تعديل Dulbecco لوسط النسر) مع 4.5 جم / لتر من الجلوكوز و L-glutamine وبيروفات الصوديوم</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>صيانة خلايا HEK</td></tr><tr><td>Dulbecco s الفوسفات المخزن الملحي PBS (1X)</td> <td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>تمرير / حصاد خلية HEK</td></tr><tr><td>حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك</td><td>Sigma</td><td>ED-500G</td><td>حصاد خلايا HEK</td></tr><tr><td>قوارير ثقافة فالكون ذات التهوية ، 75 سم 2 منطقة النمو</td><td>Corning</td><td>9381M26</td><td>زراعة خلايا HEK</td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنيني</td><td>Sigma</td><td>17L184</td><td>صيانة</td></tr> <tr>خلايا HEK<td>HEK293T خلايا</td><td>ATCC</td><td></td><td>نظام نموذج</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>V: 2.0.0-rc-69 / 1.52p</td><td>تحليل الصور</td></tr><tr><td>سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم</td><td>Sigma</td><td>M9272-500G</td><td>HEK إعادة تعليق خلية</td></tr><tr><td>فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة اللامائي</td><td>فيشر الكواشف الحيوية</td><td>BP332-500</td><td>تعداء فوسفات الكالسيوم</td></tr><tr><td>التربسين 0.25٪ (1X) الحل</td><td>GE Healthcare Life العلوم</td><td>SH30042.01</td> مرور <td>خلايا HEK</td></tr><tr><td>حضانة أنبوب دوار</td><td></td><td></td><td>لمجموعات مختلطة من خلايا HEK</td></tr><tr><td>شرائح مجهر فائق الوضوح. وايت فروستيد ، إيجابي تهمة</td><td>دينفيل العلمية.</td><td>الحصول</td>على <td>صورة M1021</td></tr><tr><td>مجهر واسع المجال</td><td>Zeiss</td><td>Axio Vert 200M</td><td>الحصول على صورة</td></tr></tbody></table>

قياس التفاعلات عبر الخلية من خلال تجميع البروتين في نظام الخلايا heterologous

Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System

التفاعلات البروتينية في الواجهات الخلوية تملي العديد من النتائج البيولوجية التي تتراوح بين تطوير الأنسجة وتطور السرطان إلى تشكيل المشبك العصبي والصيانة. العديد من هذه التفاعلات الأساسية تحدث في مغايرة وعادة ما يتم الناجمة عن التفاعلات غير المتغايرة أو المثلية بين الخلايا التي تعبر عن أزواج الربط الراسية الغشاء. توضيح كيف الطفرات المرض ذات الصلة تعطيل هذه التفاعلات البروتين الأساسية يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في عدد لا يحصى من حقول بيولوجيا الخلايا. العديد من البروتين البروتين التفاعل المقايسة لا عادة توضيح بين رابطة الدول المستقلة والتفاعلات عبر, مما قد يؤدي إلى المبالغة في تقدير مدى الربط الذي يحدث في الجسم الحي وينطوي على تنقية كثيفة العمالة من البروتين و / أو معدات الرصد المتخصصة. هنا، نقدم بروتوكول بسيط الأمثل الذي يسمح لمراقبة وكمية التفاعلات عبر فقط دون الحاجة إلى تنقية البروتين طويلة أو المعدات المتخصصة. يتضمن فحص تجميع خلايا HEK خلط مجموعتين مستقلتين من خلايا HEK، يعبر كل منهما عن أربطة مزدوجة مُلزمة بالغشاء. بعد فترة حضانة قصيرة، يتم تصوير العينات ويتم تحديد المجاميع الناتجة.

طفرة A687T يزيد Neurexin3α SS4- ملزمة LRRTM27 للتحقيق في كيفية تأثر التفاعلات بين الخلايا من اثنين من البروتينات متشابك المعروفة من خلال إدخال طفرة نقطة وجدت في المريض مع الإعاقة الفكرية والصرع، استخدمنا أعلاه هيك خلية تجميع المقايسة(الشكل 1). وقد تم نقل الخلايا وفقا للقسم 1 وأعدت للتصوير وفقا للقسمين 1 و 2 من البروتوكول. تم تصوير الخلايا عند خط الأساس حيث لم يتم ملاحظة أي تجميع كما هو متوقع (غير مبين). وتم تحليل الصور التي تم الحصول عليها في 60 دقيقة كما هو ال...

هنا، نقدم بروتوكول الأمثل لقياس بسرعة وشبه متزامنة التفاعلات مستقبلات رابطة في trans في نظام خلية غير متغايرة باستخدام المجهر الفلورية.

Protein interactions at cellular interfaces dictate a multitude of biological outcomes ranging from tissue development and cancer progression to synapse ...

يسمح الاختبار القائم على الخلية بمراقبة وقياس تفاعلات الالتصاق العابرة دون الحاجة إلى تنقية طويلة للبروتين أو معدات متخصصة. على الرغم من أن تفاعلات البروتين التي تم اختبارها هنا ذات صلة بعلم الأعصاب ، إلا أنه يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي مجال من مجالات البحث حيث يحدث التصاق البروتين بين الخلايا. بعد 48 ساعة من نقل خلايا HEK-293T ، قم بحصاد الخلايا من الصفيحة المكونة من ستة آبار للتجميع.أولا ، اغسل كل بئر مرتين باستخدام PBS. بعد ذلك ، لفصل الخلايا برفق ، أضف ملليلترا واحدا من 10 ملليمولار EDTA إلى كل بئر ، ثم احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية. بعد خمس دقائق من الحضانة ، اضغط برفق على اللوحة لفصل الخلايا وحصاد كل بئر في أنبوب مخروطي منفصل سعة 15 مل.الطرد المركزي الأنابيب عند 500 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. أثناء تكوير الخلايا ، قم بإعداد ستة أنابيب حضانة عن طريق وضع العلامات على قمم أنابيب الطرد المركزي الدقيقة بالظروف التجريبية. يجب استخدام كل تبديل من GFP و mCherry .قم بإزالة المادة الطافية من الأنابيب المخروطية سعة 15 مليلتر وأعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من المتوسط. باستخدام مقياس كثافة الدم ، عد الخلايا في كل أنبوب مخروطي. ثم قم بنقل 200 ، 000 خلية من كل حالة إلى أنبوب الحضانة المناسب لمزيج واحد لواحد بحجم إجمالي يبلغ 500 ميكرولتر.بعد تقييم التجميع الأساسي الموصوف في القسم التالي ، ضع أنابيب الحضانة في دوار أنبوب بطيء في درجة حرارة الغرفة. لتقييم التجميع ، عند خط الأساس ومرة أخرى بعد 60 دقيقة ، قم بإدخال 40 ميكرولتر من أنبوب الحضانة على شريحة مجهر مشحونة. يجب أن يتم اكتساب خط الأساس في أسرع وقت ممكن بعد إضافة الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق.قم بتصوير الشريحة تحت التألق في كل من القناتين الخضراء والحمراء. لكل شريحة، التقط صورا لثلاثة مجالات رؤية مختلفة في مستوى بؤري واحد. تم نقل خلايا HEK-293T ببروتين مثير للاهتمام ، أو بروتين متحور ذي أهمية ، أو رابط ذي أهمية وشاركت مع بروتين فلورسنت.تم خلط مجموعات الخلايا التي تعبر عن البروتين محل الاهتمام مع مجموعات الخلايا التي تعبر عن الترابط محل الاهتمام وتقييمها للتجميع بعد 60 دقيقة. في تراكبات الصور الملتقطة في القناتين الخضراء والحمراء ، يظهر التجميع على شكل نقطة صفراء. أظهرت الظروف التي لم تعبر فيها الخلايا عن أي روابط متشابكة الحد الأدنى من التجميع.أيضا ، تم عرض الحد الأدنى من التجميع عندما كان واحد فقط من المجموعتين يعبر عن روابط متشابكة. لم يظهر أي تجميع عندما عبرت مجموعتان من الخلايا عن جزيئات التصاق غير متوافقة. أظهرت الظروف ذات جزيئات الالتصاق المتوافقة تراكما كبيرا بعد حضانة لمدة 60 دقيقة.والمثير للدهشة أن البروتين المتحور المعني أظهر تجميعا أكبر بكثير من نظيره من النوع البري ، مما يشير إلى أن الطفرة النقطية تعزز قدرات ربط البروتينات. ترتبط الطفرات في العديد من جزيئات الالتصاق عادة باضطرابات النمو العصبي والعصبي والنفسي والإدمان. باستخدام هذه التقنية ، يمكن للمرء فحص آثار الطفرات النقطية ذات الصلة بالمرض على التفاعلات المتحولة.

measuring-transcellular-interactions-through-protein-aggregation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

في هذا الفيديو ، نوضح مقايسة تجميع البروتين القائم على الخلايا باستخدام مثبطات البروتيازوم ، والتي تمنع نشاط البروتيازوم ، وتمنع البروتينات الطافرة غير المطوية ، المدمجة في ملصق الفلورسنت ، من الخضوع لتدهور البروتيازوم المعتمد على اليوبيكويتين ، مما يؤدي إلى تراكمها داخل سيتوبلازم الخلية. ثم يتم تصور مجاميع البروتين وقياسها كميا عن طريق الفحص المجهري الفلوري.

مقايسة تكوين البروتين الكلي: طريقة للكشف عن تراكم البروتين وتحديده في الخلايا المستنبتة عند الحث بواسطة مثبط البروتيازوم

في هذا الفيديو ، نوضح تقنية قياس التفاعلات عبر الخلايا بين جزيئات التصاق الخلايا المشبكية من خلال مقايسة تجميع خلايا HEK. في هذا الفحص ، يتم خلط عدد متساو من خلايا HEK التي تعبر عن جزيء التصاق الخلية قبل المشبكي المطلوب وبروتين الفلورسنت مع خلايا HEK التي تعبر عن جزيء التصاق الخلية بعد التشابك وبروتين فلوري آخر. يجبر التفاعل بين جزيئات التصاق الخلية الخلايا على التجمع ، والتي يمكن قياسها عن طريق المجهر الفلوري.

مقايسة تجميع الخلايا للكشف عن التفاعلات العابرة بين جزيئات التصاق الخلايا

في هذا الفيديو ، نوضح تقنية التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي داخل الخلية لدراسة تفاعلات البروتين والترابط بين البروتينات غير المسماة والجزيئات الصغيرة. يتم تأكيد التفاعل الناجح بين البروتين الرابطي بصريا من خلال ظهور مجموعة إضافية من القمم في المنطقة الطيفية ذات الأهمية التي تحل تدريجيا محل القمم الأصلية.

التحليل الطيفي الكمي للهيدروجين داخل الخلية بالرنين المغناطيسي النووي لمراقبة تفاعلات البروتين والترابط

الجدوى الخلوية تعتمد على إدارة الوقت المناسب والفعال للmisfolding البروتين. نحن هنا وصف طريقة لتصور مصائر مختلفة المحتملة للبروتين تتجمع: طوي ثانية، وتدهور، أو عزل في الادراج. نحن لشرح استخدام جهاز استشعار للطي،...

4D التصوير التجميع البروتين في الخلايا الحية

نقدم هنا طريقة بسيطة وسريعة لتوصيف الخصائص اللاصقة الجوهرية لجزيئات التصاق الخلية المفترضة.  يتم التقاط المجال الخارجي المفرز الذي يحمل علامة حاتمة لجزيء التصاق الخلية من وسط الاستزراع على حبات وظيفية صغيرة موحدة.  يمكن بعد ذلك استخدام هذه الخرزات على الفور في فحوصات تجميع الخرزات البسيطة.

حبة تجميع فحوصات لتوصيف المزعومين خلية التصاق جزيئات

قلة القلة لمستقبلات الريانودين ، وهي قناة أيونية متجانسة رباعي الذراع في إطلاق Ca2+ من المخازن داخل الخلايا ، أمر بالغ الأهمية لتقلص الهيكل العظمي وعضلات القلب. هنا ، نقدم طرقا تكميلية في الجسم الحي وفي المختبر للكشف عن الارتباط الذاتي للبروتين وتحديد القياس المتكافئ المثلي قليل القلة.

النهج الوراثية والبيوكيميائية ل<em&gt; في فيفو</em&gt; و<em&gt; في المختبر</em&gt; تقييم Oligomerization البروتين: دراسة حالة Ryanodine مستقبلات

ويصف هذا البروتوكول اتباع نهج قائم على التحليل الطيفي تقلب الأسفار للتحقيق في التفاعلات بين البروتينات بوساطة التفاعلات خلية خلية، أي البروتينات المترجمة في تقاطعات الخلية، مباشرة في الخلايا الحية. نحن توفير مبادئ توجيهية مفصلة على صك المعايرة والحصول على البيانات وتحليلها، بما في ذلك تصحيحات لمصادر الحرفية الممكنة.

تحليل الطيفي تقلب Fluorescence من تفاعلات البروتين البروتين في الخلية جهات الاتصال

تتعاون بروتينات Cognate J-domain مع مرافق Hsp70 للمساعدة في عدد لا يحصى من العمليات البيولوجية التي تتراوح بين طي البروتين إلى التدهور. هنا، ونحن نصف دراسة الربط القرب في الموقع، والذي يسمح برصد هذه الآلات مرافقة شكلت عابرة في الخلايا البكتيرية والخميرة والبشرية.

الرصد في الموقع للجمعيات النكّيّازة الجزيئية المشكلة بشكل عابر في البكتيريا والخميرة والخلايا البشرية

هنا ، يتم تقديم طريقة لتحليل حركية تجميع البروتين في الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans. يتم تصوير الحيوانات من مجموعة سكانية متزامنة مع العمر في نقاط زمنية مختلفة ، تليها عد التضمين شبه الآلي في CellProfiler وتناسبها مع نموذج رياضي في AmyloFit.

مراقبة حركية تجميع البروتين في الجسم الحي باستخدام عد التضمين الآلي في Caenorhabditis elegans

هنا ، نصف طريقة للتعبير البكتيري المشترك للبروتينات الموسومة تفاضليا باستخدام مجموعة من النواقل المتوافقة ، تليها تقنيات السحب التقليدية لدراسة مجمعات البروتين التي لا يمكن أن تتجمع في المختبر.

مقايسة السحب إلى جانب التعبير المشترك في خلايا البكتيريا كأداة فعالة من حيث الوقت لاختبار التفاعلات الصعبة بين البروتين والبروتين

لقد ثبت أن العديد من البروتينات المضطربة جوهريا تشارك في تكوين المكثفات الجزيئية الحيوية الديناميكية للغاية ، وهو سلوك مهم للعديد من العمليات الخلوية. هنا ، نقدم طريقة قائمة على التصوير أحادي الجزيء لتحديد الديناميات التي تتفاعل بها البروتينات مع بعضها البعض في المكثفات الجزيئية الحيوية في الخلايا الحية.

قياس جزيء واحد لديناميكيات تفاعل البروتين داخل المكثفات الجزيئية الحيوية

اكتشف بروتوكولًا محسّنًا لقياس تفاعلات البروتين عبر الخلية بسرعة باستخدام مجهر الفلورسنس في خلايا HEK-293T. تُمكّن هذه الطريقة الباحثين من دراسة التصاق البروتينات في علم الأعصاب والمجالات البيولوجية الأخرى.

قياس التفاعلات عبر الخلية من خلال تجميع البروتين في نظام الخلايا heterologous

استكشف المزيد من الفيديوهات