مقايسة تكوين البروتين الكلي: طريقة للكشف عن تراكم البروتين وتحديده في الخلايا المستنبتة عند الحث بواسطة مثبط البروتيازوم

يتم تنظيم إزالة البروتينات غير المطوية في الخلية بشكل رئيسي بواسطة نظام اليوبيكويتين الخلوي والبروتيازوم ، حيث يتم التعرف على البروتين لأول مرة وتمييزه بواسطة يوبيكويتين ، وهو بروتين تنظيمي صغير ، ويتم تهريبه إلى البروتيازوم ، وهو مركب متعدد البروتينات ، للتحلل المائي والتخليص.

يمكن أن يتسبب ضعف نشاط نظام البروتين في اليوبيكويتين ، وهو أمر شائع في الأمراض التنكسية العصبية ، في تراكم البروتينات غير المطوية داخل الخلايا ، مما يشكل مجاميع بروتينية غير قابلة للذوبان ذات تأثيرات سامة للخلايا.

لتصور وقياس تراكم البروتين في المختبر ، احصل على تعليق لخلايا الثدييات المنقولة - معبرا عن بروتين متحور يحمل علامة الفلورسنت يتبنى شكلا غير مطوي مع بقايا كارهة للماء المكشوفة - في وسائط مناسبة.

تزيد الماصة من تركيزات مثبط البروتيازوم على آبار صفيحة سوداء متعددة الآبار لتقليل مضان الخلفية أثناء التصوير. بذر معلق خلايا الثدييات في الآبار. احتضان للسماح للخلايا بالالتصاق بقاع اللوحة والتكاثر.

بمجرد دخوله ، يرتبط مثبط البروتيازوم بالمواقع المحللة للبروتيازوم ويمنع نشاطه ، مما يتسبب في تراكم البروتينات الطافرة المعبر عنها ، والتي تتفاعل بعد ذلك عبر بقاياها الكارهة للماء المكشوفة وتشكل مجاميع سيتوبلازمية ، مما يؤدي في النهاية إلى موت الخلايا.

أضف صبغة ملزمة للحمض النووي الفلوري لتلطيخ نوى الخلية. صور اللوحة. تظهر مجاميع البروتين الطافرة الفلورية مشتتة داخل السيتوبلازم غير الملوث.

الآبار التي تحتوي على تركيزات أعلى من مثبطات البروتيازوم أعدادا مجمعة للبروتين إلى نسبة عدد الخلايا أعلى من الآبار ذات التركيزات المنخفضة لمثبطات البروتيازوم.

لنقل المركب ، على لوح بولي بروبيلين تخزين 384 بئرا ، أضف تخفيفات تسلسلية للمركبات بواسطة سلسلة التخفيف القياسية من 1 إلى 3. بعد ذلك ، باستخدام معالج سائل مزود برأس 384 شعريا ، قم بتوزيع 0.25 ميكرولتر من مثبطات البروتيازوم على ألواح فحص سوداء مسطحة القاع 384 بئر. ثم ، قم بزرع 1.5 × 10⁴ خلايا على هذه اللوحات. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة.

قبل تصوير خط الخلية المعالج بمثبطات البروتيازوم ، أضف 10 ميكرولترات من DMEM الدافئ مسبقا بمحلول تلطيخ واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

بعد التلوين ، ابدأ تشغيل برنامج تشغيل المجهر الآلي عن طريق تحديد علامة التبويب "المجهر". أولا ، حدد علامة التبويب "التكوين" ، ثم حدد هدف 20X ونوع اللوحة الصحيح.

للسماح بالتركيز المناسب مع أنواع مختلفة من اللوحات ، تأكد من ضبط "الياقة" على القيمة الصحيحة على الهدف.

بعد ذلك ، حدد "التعريض الضوئي 1" ، واضبط ارتفاع التركيز على "0 ميكرومتر" ، ثم حدد "التركيز". بمجرد التركيز البؤري ، قم بتعريض الكاميرا 1.

لتحسين مستوى التعريض الضوئي ، اضبط ارتفاع التركيز وانقر على "أخذ الارتفاع". قم بتغيير أوقات التعريض الضوئي في طاقة الليزر للحصول على أقصى كثافة بكسل تبلغ حوالي 3,000 بكسل ، وحفظ معلمات التعريض الضوئي.

حدد علامة التبويب "تعريف التجربة". أنشئ تخطيطا وتخطيطا فرعيا. بعد ذلك ، قم بسحب وإسقاط التخطيط ذي الصلة ، والتعرض ، والصورة المرجعية ، وملف الانحراف ، والتخطيط الفرعي. ثم احفظ التجربة.

أخيرا ، حدد علامة التبويب "التجربة التلقائية" واحصل على الصور. بالنسبة للصور ذات القناتين ، حدد أولا خوارزمية البرنامج لتقسيم الكائنات الأساسية ، مثل النوى والعزلة الخلوية والتجميعات.