تطبيق Microdissection الليزر لكشف النسخ الإقليمية في أنسجة الكلى البشرية

يسمح التشريح المجهري بالليزر بالتحليل النسخي للمناطق المحددة مكانيا داخل عينات أنسجة الكلى. يتيح لنا هذا فرصة فريدة لتحديد الهياكل ذات الأهمية حتى بعد حدوث التغييرات الناجمة عن المرض. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه المنهجية في تكاملها مع تقنيات omics الأخرى ، مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.

إنه يوفر اقتصادا ملحوظا في الأنسجة ويسمح بالكشف عن النصوص المعبر عنها بشكل متواضع. بعد الحصول على عينة الأنسجة ، استخدم ناظم البرد على درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لقطع العينة بسمك 12 ميكرومتر واستخدم محول الشريحة لتثبيت العينة على شريحة تشريح دقيق ليزر متخصصة. في غضون 10 أيام من التقطيع بالتبريد ، امزج 89.2 ميكرولتر من 10٪ BSA الخالي من RNase في PBS مع أربعة ميكرولترات من الفالودين FITC ، و 1.5 ميكرولتر من DAPI ، وميكرولترين من الجسم المضاد محل الاهتمام المقترن مباشرة ب Alexa Fluor 546 ، و 3.3 ميكرولتر من مثبط RNase.

اغسل الشريحة في درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر 100٪ أسيتون لمدة دقيقة واحدة وضع الشريحة في غرفة الرطوبة. اغسل الجزء العلوي من الشريحة مرتين باستخدام PBS جديد خال من RNase لمدة 30 ثانية لكل غسلة ، متبوعا بغسلتين لمدة 30 ثانية مع 10٪ BSA في PBS الخالي من RNase. بعد الغسيل الأخير ، عالج العينة بمحلول الأجسام المضادة المحضر لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل غسلها مرتين أخريين باستخدام 10٪ BSA في PBS الخالي من RNase.

بعد الغسيل الثاني ، جفف الشريحة بالهواء لمدة خمس دقائق في غطاء مزرعة الأنسجة قبل تحميل الشريحة على منصة قطع التشريح الدقيق بالليزر. قم بتركيب أنابيب تجميع أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 500 ميكرولتر ، ومناسبة لأعمال PCR ، وتحتوي على 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت للاستخراج من مجموعة عزل الحمض النووي الريبي على الجهاز. بعد التحميل ، حدد مناطق الاهتمام داخل العينة عن طريق التلوين والتشكل والموقع.

استخدم التألق المناعي لتحديد ما لا يقل عن 500،000 ميكرومتر مربع من الأجزاء ذات الأهمية. ثم ابدأ التشريح الدقيق بالليزر لاستئصال المنطقة باستخدام قوة ليزر أكبر من 40. عند الانتهاء من عملية التشريح الدقيق بالليزر ، قم بتغطية أنابيب تجميع أجهزة الطرد المركزي الدقيقة ونفض الغبار عن الأنابيب بقوة لضمان انتقال المحتويات من الأغطية إلى قيعان الأنابيب.

بعد الطرد المركزي ، احتضان الأنابيب في حمام مائي 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل الطرد المركزي للأنابيب مرة أخرى. ثم انقل المواد الطافية إلى أنابيب جديدة سعة 500 ميكرولتر من تخزين 80 درجة مئوية تحت الصفر. يتم تحديد الأجزاء الفرعية الأنبوبية في الكلى من خلال تلطيخ الأجسام المضادة للعلامات الأنبوبية الفريدة بالإضافة إلى مورفولوجيا الخلايا والمعالم الهيكلية.

وضع العلامات الفلورية جنبا إلى جنب مع ميزات الأنسجة المورفولوجية وتحديد المواقع المكانية لهياكل الصورة تصور الأجزاء الفرعية الكلوية بدرجة عالية من الثقة. في تحليل التسلسل التمثيلي هذا ، كان معدل نجاح تلبية الحد الأدنى من مدخلات منطقة التشريح أكبر من 90٪ مما أدى إلى ارتفاع كمية mRNA الإجمالية المتاحة للكشف عن الجينات. في هذا التحليل ، استوفت 100٪ من العينات الحد الأدنى من عتبة الكشف التي لا تقل عن 10،000 جين.

بعد التشريح المجهري بالليزر ، يمكن مقارنة تحليل التخصيب للتعبير الجيني للعلامات المعروفة بتلك الموجودة في المقصورات الأخرى. في هذا التحليل ، تم تحديد علامة واحدة لكل جزء فرعي من خلال النسخ الإقليمية للتشريح المجهري بالليزر والتي أسفرت أيضا عن تلطيخ كيميائي مناعي محدد للجزء الفرعي المقابل. من المهم ملاحظة أن التشريح الدقيق بالليزر يعتمد بشكل كبير على خبرة المستخدم لتحديد الهياكل ذات الأهمية المراد تشريحها بدقة.

تسمح هذه التقنية بدراسة توقيعات التعبير الجيني الإقليمية المحددة التي يمكن استخدامها لتقييم المسارات المحتملة المشاركة في تطور المرض ، بالإضافة إلى بيولوجيا الأنسجة السليمة.