تطبيق Microdissection الليزر لكشف النسخ الإقليمية في أنسجة الكلى البشرية
يونيو 9, 2020
نحن وصف بروتوكول للmicrodissection الليزر من أجزاء فرعية من الكلى البشرية، بما في ذلك كبيبات الكبيب، tubule القريب، سميكة صعود الطرف، وجمع القناة والتهائل. ثم يتم عزل الجيش الملكي النيبالي عن المقصورات التي تم الحصول عليها ويتم تنفيذ تسلسل الحمض النووي الريبي لتحديد التغييرات في التوقيع النسخي داخل كل جزء فرعي.
يسمح التشريح المجهري بالليزر بالتحليل النسخي للمناطق المحددة مكانيا داخل عينات أنسجة الكلى. يتيح لنا هذا فرصة فريدة لتحديد الهياكل ذات الأهمية حتى بعد حدوث التغييرات الناجمة عن المرض. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه المنهجية في تكاملها مع تقنيات omics الأخرى ، مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.
إنه يوفر اقتصادا ملحوظا في الأنسجة ويسمح بالكشف عن النصوص المعبر عنها بشكل متواضع. بعد الحصول على عينة الأنسجة ، استخدم ناظم البرد على درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لقطع العينة بسمك 12 ميكرومتر واستخدم محول الشريحة لتثبيت العينة على شريحة تشريح دقيق ليزر متخصصة. في غضون 10 أيام من التقطيع بالتبريد ، امزج 89.2 ميكرولتر من 10٪ BSA الخالي من RNase في PBS مع أربعة ميكرولترات من الفالودين FITC ، و 1.5 ميكرولتر من DAPI ، وميكرولترين من الجسم المضاد محل الاهتمام المقترن مباشرة ب Alexa Fluor 546 ، و 3.3 ميكرولتر من مثبط RNase.
اغسل الشريحة في درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر 100٪ أسيتون لمدة دقيقة واحدة وضع الشريحة في غرفة الرطوبة. اغسل الجزء العلوي من الشريحة مرتين باستخدام PBS جديد خال من RNase لمدة 30 ثانية لكل غسلة ، متبوعا بغسلتين لمدة 30 ثانية مع 10٪ BSA في PBS الخالي من RNase. بعد الغسيل الأخير ، عالج العينة بمحلول الأجسام المضادة المحضر لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل غسلها مرتين أخريين باستخدام 10٪ BSA في PBS الخالي من RNase.
بعد الغسيل الثاني ، جفف الشريحة بالهواء لمدة خمس دقائق في غطاء مزرعة الأنسجة قبل تحميل الشريحة على منصة قطع التشريح الدقيق بالليزر. قم بتركيب أنابيب تجميع أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 500 ميكرولتر ، ومناسبة لأعمال PCR ، وتحتوي على 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت للاستخراج من مجموعة عزل الحمض النووي الريبي على الجهاز. بعد التحميل ، حدد مناطق الاهتمام داخل العينة عن طريق التلوين والتشكل والموقع.
استخدم التألق المناعي لتحديد ما لا يقل عن 500،000 ميكرومتر مربع من الأجزاء ذات الأهمية. ثم ابدأ التشريح الدقيق بالليزر لاستئصال المنطقة باستخدام قوة ليزر أكبر من 40. عند الانتهاء من عملية التشريح الدقيق بالليزر ، قم بتغطية أنابيب تجميع أجهزة الطرد المركزي الدقيقة ونفض الغبار عن الأنابيب بقوة لضمان انتقال المحتويات من الأغطية إلى قيعان الأنابيب.
بعد الطرد المركزي ، احتضان الأنابيب في حمام مائي 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل الطرد المركزي للأنابيب مرة أخرى. ثم انقل المواد الطافية إلى أنابيب جديدة سعة 500 ميكرولتر من تخزين 80 درجة مئوية تحت الصفر. يتم تحديد الأجزاء الفرعية الأنبوبية في الكلى من خلال تلطيخ الأجسام المضادة للعلامات الأنبوبية الفريدة بالإضافة إلى مورفولوجيا الخلايا والمعالم الهيكلية.
يسهلوضع العلامات الفلورية جنبا إلى جنب مع ميزات الأنسجة المورفولوجية وتحديد المواقع المكانية لهياكل الصورة تصور الأجزاء الفرعية الكلوية بدرجة عالية من الثقة. في تحليل التسلسل التمثيلي هذا ، كان معدل نجاح تلبية الحد الأدنى من مدخلات منطقة التشريح أكبر من 90٪ مما أدى إلى ارتفاع كمية mRNA الإجمالية المتاحة للكشف عن الجينات. في هذا التحليل ، استوفت 100٪ من العينات الحد الأدنى من عتبة الكشف التي لا تقل عن 10،000 جين.
بعد التشريح المجهري بالليزر ، يمكن مقارنة تحليل التخصيب للتعبير الجيني للعلامات المعروفة بتلك الموجودة في المقصورات الأخرى. في هذا التحليل ، تم تحديد علامة واحدة لكل جزء فرعي من خلال النسخ الإقليمية للتشريح المجهري بالليزر والتي أسفرت أيضا عن تلطيخ كيميائي مناعي محدد للجزء الفرعي المقابل. من المهم ملاحظة أن التشريح الدقيق بالليزر يعتمد بشكل كبير على خبرة المستخدم لتحديد الهياكل ذات الأهمية المراد تشريحها بدقة.
تسمح هذه التقنية بدراسة توقيعات التعبير الجيني الإقليمية المحددة التي يمكن استخدامها لتقييم المسارات المحتملة المشاركة في تطور المرض ، بالإضافة إلى بيولوجيا الأنسجة السليمة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولاً للتشريح الدقيق بالليزر لأجزاء فرعية محددة داخل أنسجة الكلى البشرية، بما في ذلك الكبيبة والأنبوب القريب. يتيح الحمض النووي الريبوزي (RNA) المعزول من هذه المقصورات إجراء تحليل ترانسكريبتومي للكشف عن التغيرات في أنماط التعبير الجيني المرتبطة بهياكل الكلى المختلفة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال البحث
- التحليل الترانسكريبتومي
- بيولوجيا الكلى
- استقصاء تطور المرض
خلفية علمية
- أهمية دراسة القطاعات الفرعية للكلى
- التحديات في تحليل البنى المحددة مكانياً بعد الإصابة بالمرض
- التكامل مع تقنيات الأوميكس الأخرى
الطرق المستخدمة
- التشريح الدقيق بالليزر
- عينات من أنسجة الكلى البشرية
- عزل الحمض النووي الريبي (RNA) وتسلسله
النتائج الرئيسية
- معدل نجاح مرتفع في عملية التشريح واستعادة الـ RNA
- تحديد علامات التعبير الجيني للأجزاء الفرعية للكلى
- توضيح المسارات المحتملة المرتبطة بتطور المرض
الاستنتاجات
- يوضح هذا البروتوكول طريقة فعالة لدراسة التعبير الجيني الإقليمي في الكلية.
- تساهم هذه النتائج في فهم بيولوجيا الكلى وآليات المرض المحتملة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح التشريح الدقيق بالليزر إجراء تحليل ترانسكريبتومي بدقة مكانية لأنسجة الكلى البشرية، مما يعالج فجوة حرجة في بيولوجيا الاكتشاف حيث تفتقر الطرق القائمة على التفكيك إلى السياق التشريحي. ويدعم هذا النهج التحقق من الأهداف من خلال ربط بصمات التعبير الجيني بأجزاء فرعية محددة من النيفرون، مما يعزز تقليل المخاطر الميكانيكية في نماذج أمراض الكلى. توفر هذه الطريقة ثقة تنبؤية لاستقصاء المسارات وتحديد أولويات المحافظ في تدفقات عمل الاكتشاف المبكر.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال ربط التعبير الجيني بمقصورات كلوية محددة تشريحيًا.
- القيمة التشغيلية: تدعم تقليل المخاطر البيولوجية من خلال بصمات ترانسكريبتومية مثبتة مكانيًا تحافظ على سياق الأنسجة.
- القيمة التنبؤية: تسهل تعزيز الثقة في الأهداف عن طريق ربط التعبير عن المؤشرات الإقليمية بهوية القطع الفرعية الوظيفية.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: تجهيز أنظمة بيولوجية مصدق عليها لسير عمل الأوميكس اللاحقة عن طريق عزل RNA عالي النزاهة من مناطق تم تشريحها مجهرياً.
- القيمة التشغيلية: ضمان توحيد المقايسة وقابلية تكرارها من خلال معايير مراقبة الجودة التي تقيم كفاية العينة ومعدلات نجاح التشريح.
- القابلية للتوسع: تمكين التقييم الموثوق للمركبات من خلال توفير مخرجات ترانسكريبتومية كمية ومحددة مكانياً لحملات الفرز.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الترجمية: تربط نتائج الاكتشاف بالتحقق قبل السريري من خلال نمذجة الأنظمة ذات الصلة بالمرض باستخدام قطاعات فرعية من الكلى البشرية.
- مواءمة المؤشرات الحيوية: تدعم تطوير المؤشرات الحيوية الترجمية من خلال تحديد ملفات التعبير الجيني الخاصة بكل مقصورة والتي يمكن اكتشافها في الأنسجة.
- التقدم المعدل حسب المخاطر: ترفد عملية اتخاذ القرار قبل السريرية من خلال الكشف عن نشاط المسارات في المناطق المتأثرة بالمرض بدقة تشريحية.
تكامل مسار العمل وسير العمل
يندرج التشريح المجهري بالليزر ضمن سلسلة الاكتشافات بدءاً من اختبار الفرضيات وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة، مما يتيح إجراء توصيف جزيئي دقيق مكانياً يربط بين التصوير والعلوم الأوميكس.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات من خلال ربط التعبير الجيني بالعلامات التركيبية في أنسجة الكلى.
- الفحص: توفر الجاهزية للمقايسة من خلال معدل نجاح عالٍ في التشريح (>90%) وإنتاج كمية كافية من RNA لتطبيقات التسلسل.
- التحليلات: توفر قياسات كمية للمتغيرات التابعة (عتبات الكشف عن الجينات ≥10,000 جين) مما يسمح بالمقارنة بين الظروف المختلفة.
- الأبحاث الانتقالية: تعزز الاستمرارية في المرحلة قبل السريرية من خلال الحفاظ على السياق المكاني الذي يُفقد في طرق التفكيك القائمة على الفصل.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تعمل كقدرة قابلة لإعادة الاستخدام عبر أنواع مختلفة من الأنسجة من خلال استبدال الواسمات الأجسام المضادة، مما يدعم الاعتماد على نطاق المنصة بالكامل.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية من خلال تقليل الغموض الميكانيكي في التحقق من الأهداف الكلوية.
- القيمة التشغيلية: تعزز التوحيد القياسي وقابلية التكرار من خلال معايير سير العمل المحددة ونقاط تفتيش مراقبة الجودة.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المتابعة أو التوقف (go/no-go) عن طريق تمكين تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر بناءً على البيولوجيا الخاصة بكل شريحة فرعية.
- التأثير على المحفظة: تدعم كفاءة رأس المال من خلال التخفيف المبكر لمخاطر الأهداف الكلوية باستخدام أدلة ذات دقة مكانية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في صبغ الفلورة المناعية والتعرف المورفولوجي على القطع الفرعية الكلوية.
- يعتمد على منصات التشريح الدقيق بالليزر وأطقم عزل RNA المتوافقة مع العينات ذات المدخلات المنخفضة.
- يستلزم توحيد المعايير بين الفرق فيما يتعلق ببروتوكولات الصبغ، وعتبات التشريح، ومقاييس مراقبة الجودة.
- يتطلب التكيف عبر النماذج المختلفة التحقق من صحة علامات الأجسام المضادة والمعالم الهيكلية في الأنسجة المستهدفة.
- تشمل القيود العملية الدقة المعتمدة على المستخدم في تحديد المناطق والحفاظ على سلامة RNA أثناء المعالجة.
