التطبيقية ليزر Microdissection التنميط التعبير الجيني للخلايا من المجموعة الثانوية من ذبابة الفاكهة جناح القرص

نقدم هنا وصفا شاملا للتشريح الدقيق بالليزر المطبق لتحقيق التنميط المقارن لنسخة الحمض النووي الريبي للمناطق الصامتة وغير الصامتة من قرص جناح ذبابة الفاكهة. يتطلب هذا النهج كمادة بيولوجية ، أقراص صورة ذبابة الفاكهة التي تم تشريحها يدويا كمعدات رئيسية ، وتشريح دقيق بالليزر. نحن نستخدم LI A-L-L-M-D 6 ، 000 وجهاز PCR في الوقت الحقيقي.

استخدمنا معدل ذكاء BioRad. خمس أدوات صغيرة مطلوبة هي صفيحة مقعرة ، وفرشاة رسم صغيرة ، وملقط تشريح دقيق معلقة ، وشرائح الحشرات ، مثبتة على إبر الحقنة ، وإطار معدني مع أنابيب بلاستيكية صغيرة لغشاء الأليفة. تتضمن هذه الطريقة الخطوات التالية.

الخطوة الأولى لعبور خطين معدلين وراثيا مناسبين من أجل تحفيز إسكات جيني موضعي ومحدد، في ذرية باستخدام نظام GAL الأربعة بدون طيار. الخطوة الثانية ، لمعالجة إطارات التشريح. الخطوة الثالثة ، لإعداد التشريح الدقيق بالليزر.

الخطوة الرابعة ، لجمع الأقراص الخيالية للجناح يدويا من ذرية يرقات الصليب الجيني. الخطوة الخامسة ، لإجراء التشريح الدقيق بالليزر لمناطق معينة من الأقراص الخيالية المسماة GFP. الخطوة السادسة ، سيسمح توصيف النسخ للمناطق المكافئة للمناطق الصامتة وغير الصلبة من القرص بإنشاء التأثيرات الناتجة عن إسكات الجين الذي تهمك.

سيتطلب تسميته الجين X في الجسم الحي استخراج الحمض النووي الريبي من مناطق التشريح الدقيقة ، والتحكم في دقة التشريح اليدوي ، وتقييم تعبير GFP في العينتين بواسطة R-T-P-C-R ، والقياس الكمي للتعبير المفترض. أهداف جين الصمت في العينتين عن طريق R-T-P-C-R في الوقت الفعلي أو عن طريق إجراء تحليل المصفوفة الدقيقة. الآن مزيد من التفاصيل حول كل خطوة.

الخطوة الأولى ، الصليب الجيني. يتضمن التهجين الجيني GAL أربع سلالات معدلة وراثيا من الطائرات بدون طيار ويركز على الحصول على أقراص خيالية صامتة في ذرية اليرقات. يسمح لك نظام GAL الرباعي متعدد الاستخدامات بتشغيل إسكات جيني محدد وموضعي عن طريق تداخل الحمض النووي الريبي.

سلالة واحدة في الصليب الجين المعدل للسائق الذي يعبر عن GAL أربعة في نمط زمني أو مكاني محدد. ومراسل A-U-A-S-G-F-P الذي يسمح بتصور مجال التعبير الرباعي GAL. تقدم السلالة الثانية جينا معدلا للمستجيب للطيار يعبر عن الحمض النووي الريبي لإسكات دبوس الشعر ، وهو قادر على استهداف الجين X على وجه التحديد بمجرد التعبير عنه في الخلية.

يتم شق هذا الحمض النووي الريبي لتوليد الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل ، والذي يكون قادرا على إسكات الجين X المحدد على وجه التحديد في ذرية هذا الصليب. يتم نسخ الجين المعدل لإسكات الطائرات بدون طيار فقط في تلك الخلايا التي تعبر عن بروتين GAL الأربعة ، مما يؤدي إلى إسكات مقيد مكانيا للجين X. من بين مجموعة متنوعة من التطبيقات ، ركزنا على توصيف نسخة الحمض النووي الريبي في قرص الجناح الذي تم إسكاته بواسطة سائق Grailed GAL four ، والذي يوجه إسكات محدد في المقصورة الخلفية.

تتميز منطقة الصمت بالتعبير عن الجين المعدل U-A-S-G-F-P. في المقصورة الخلفية. سيتم تشغيل حدثين للتعبير عن GGFP وإسكات الجين x.

الخطوة الثانية ، معالجة إطارات التشريح لتثبيط نشاط الحمض النووي الريبي. اغسل شرائح الإطار وأدوات التشريح بماء DEPC لمدة ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة واتركها تجف في غرفة معقمة. لتثبيط نشاط الحمض النووي الريبي ، استخدم أنبوبا جديدا تماما سعة 50 مل خاليا من الحمض النووي الريبي بالفعل ، ومملوءا بماء DEPC مع ملقط يوضع في الأنبوب ، وشريحة معلقة وإطار للحيوانات الأليفة.

كلاهما مطلوب للتشريح المجهري. أغلق الأنبوب ، اقلبه رأسا على عقب ، ثم اتركه يتفاعل لمدة ساعة على الأقل. في درجة حرارة الغرفة ، بعد ساعة واحدة ، انقل ماء DEPC إلى أنبوب آخر باستخدام الملقط.

امسك الشرائح داخل الأنبوب حتى لا تسقط. ثم اترك الشرائح تجف داخل الأنبوب. الخطوة الثالثة ، إعداد microdisect.

أولا ، قم بتشغيل جميع الأجهزة المطلوبة ، لمبة التألق ، والمجهر ، وبرنامج التشريح المجهري. ستذكرك نافذة تحذير بتشغيل الليزر أيضا. افعل ذلك واترك الليزر يسخن أثناء الانتهاء من إعداد microdisect.

حان الوقت الآن لإعداد الآبار لجمع الأنسجة. قص. تسمح معدات القطع بالليزر Leica LMD 6 ، 000 بتحميل ما يصل إلى أربعة أنابيب لجمع عينات مختلفة. لغرضنا ، نحتاج إلى أنبوبين فقط.

أحدهما ، لجمع أنسجة الصمت الإيجابية GFP ، والآخر لجمع الأنسجة الأحادية السلبية GFP مع بيك صغير. املأ كلا أغطية الأنبوب ب 20 ميكرولترا من محلول الكاشف الثلاثي للحفاظ على الحمض النووي الريبي. الآن أصبح microdisect جاهزا للاستخدام الخطوة الرابعة ، التشريح اليدوي لأقراص تصوير الجناح من يرقات الجوف.

اعزل أقراص الجناح عن ذرية اليرقات التي تم الحصول عليها كما هو موضح سابقا ، وتأكد من أن الأنسجة الأخرى لا تلوث الأقراص لتحقيق هذا الهدف ، يختلف نهج التشريح تماما عن ذلك المستخدم بشكل شائع لجمع الجزء الأكبر من جميع الأقراص الأصلية. أولا ، اغسل اليرقة في محلول الرنجر لإزالة الوسائط الملتصقة. ثم انقله إلى شريحة معلقة وقطع الرأس على الفور ، وسحب الفم لأسفل.

باستخدام دبابيس الحشرات ، قم الآن بتشريح الأنسجة الأخرى بعناية. يظهر المخطط الأحمر أقراص الجناح الخيالية التي سيتم جمعها. حافظ على الأقراص خالية من الأنسجة الملتصقة بسرعة وبلطف انقل كل قرص جناح معزول إلى إطار تشريح للقطع الفوري.

يجب تكرار هذا الإجراء حتى يتم الوصول إلى العدد الإجمالي لمائة قرص جناح. الخطوة الخامسة ، التشريح الدقيق بالليزر لمناطق معينة من أقراص الجناح المسمى GFP. بمجرد وضع قرص الجناح الأصلي على الغشاء ، يمكنك متابعة القطع.

ضع الإطار على حامله وقم بتثبيت الحامل على المسرح الآلي. ابحث عن قرص الجناح الأصلي باستخدام LMD 6 ، 000 كمجهر مشترك. ركز عليها وقم بتعيين القطع.

ارسم منطقة بيضاوية تتناسب مع جانبي القرص ، ويكون GFP إيجابيا والآخر. حدد غطاء الأنبوب حيث تريد جمع الجزء الإيجابي ل GFP. اضغط على زر بدء القص.

التشريح الجزئي: يستمر في قطع الأنسجة بالسرعة والقوة التي قمت بتعيينها من قبل عن طريق تحديد الوظيفة التحريك والقطع. يمكنك تحسين القطع يدويا حتى تسقط قطعة الأنسجة غير المحددة. تظهر الرسوم المتحركة ثلاثية الأبعاد ما يحدث تحت قطع الجزئي ، حيث يركز الليزر على الأنسجة ، مما يؤدي إلى قطع على طول المحيط المحدد.

بمجرد الانتهاء من القطع ، تسقط قطعة الأنسجة في غطاء الأنبوب المحدد وبالتالي في الكاشف الثلاثي. بعد القطع الأول ، حرك منطقة القطع على الجانب الآخر من قرص الجناح لقطع منطقة سلبية مكافئة ل GFP. قبل الشروع في القطع الجديد ، تأكد من تحديد غطاء أنبوب مختلف للحفاظ على فصل الأنسجة الإيجابية ل GFP عن سلبية GFP.

اضغط على زر بدء القطع بعد القطع التلقائي. انتقل إلى تحسين القطع يدويا كما هو موضح في الرسوم المتحركة ثلاثية الأبعاد قبل القطع الثاني. تقوم المرحلة الآلية بتحريك غطاء الأنبوب المحدد أسفل منطقة القطع.

يركز شعاع الليزر على الأنسجة المقطوعة على طول المحيط المحدد ، وبمجرد الانتهاء من القطع ، تسقط قطعة الأنسجة في غطاء الأنبوب المحدد الذي يحتوي على كاشف ثلاثي. لجمع ما يكفي من المواد ، كررنا الإجراء على مائة قرص جناح خيالي. بمجرد جمع العينات ، قم بتفريغ الأنابيب.

هذه خطوة حساسة يمكن أن تجعلك تفقد كل العمل الذي قمت به حتى الآن. لذا كن حذرا. أغلق الغطاء رأسا على عقب واستمر في التجربة.

هذا هو الذي يحتوي على أنسجة إيجابية GFP. هذا هو الآخر مع الأنسجة السلبية GFP. الخطوة السادسة ، توصيف النسخ.

قم بتدوير الأنابيب لفصل السائل عن الغطاء وإضافة كاشف جرب حتى مليلتر واحد. قم بإجراء استخراج الحمض النووي الريبي باتباع بروتوكول كاشف التجربة القياسي من مائة منطقة تبلغ مساحتها حوالي 5000 ميكرومتر مربع لكل منها. كان محصولنا 1.5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي.

نستخدم ثلاثة في الجسم الزجاجي لتجميع CD NA مع سداسي عشوائي. تم التحكم في دقة التشريح اليدوي عن طريق التحقق من تعبير GFP في العينتين بواسطة R-T-P-C-R. كما هو موضح في الجل مع R-T-P-C-R الكمي.

قمنا بتقييم مستويات التعبير عن جين الصمت X جنبا إلى جنب مع تلك الخاصة بالأهداف المفترضة المحتملة للمسار التنظيمي بوساطة الجين X. يوضح هذا الرسم البياني مثالا على مستويات التعبير عن الجين X وأحد أهدافه المفترضة. أطلق عليها اسم الجينات Y فيما يتعلق بمستويات التعبير القاعدي في المقصورات الخلفية الأمامية لأقراص الجناح غير الصلبة.

تم العثور على نشاط الجين X المختار منخفضا إلى 40٪ عند إسكاته. في المقابل ، تم العثور على أحد أهدافه المفترضة ، وهو الجين Y ، وهو ينظم بشكل كبير زيادة سبعة أضعاف مما دفعنا إلى التحقق من صحة الفرضية القائلة بأنه تم تنظيمه سلبا بواسطة الجين X.