الهيكل العظمي تحليل النمط الظاهري لنموذج ماوس حذف Stat3 الشرطي

نماذج الفئران المعدلة وراثيا هي أدوات قوية لدراسة آليات الأمراض البشرية في الجسم الحي. تحليل النمط الظاهري للهيكل العظمي للفئران هو أساس أبحاث الهيكل العظمي. يصف هذا الجسيم بعض التقنيات النموذجية لتحليل النمط الظاهري للهيكل العظمي والتي قد تكون مثيرة للاهتمام لأولئك الجدد في أبحاث الأنسجة الهيكلية.

عند محاولة هذا الجسيم ، ضع في اعتبارك أن التجارب على تستغرق وقتا ، لذا اجمع أكبر عدد ممكن من العينات عالية الجودة أثناء كل تجربة ، حتى لو لم تكن بحاجة إليها على المدى القصير. ابدأ بوضع فأر مقتل رحيم في وضع ضعيف وخلع مفاصل الورك الثنائية برفق باليد. استخدم مقص العيون لقطع الجلد عموديا عن الساق البعيدة ثم إزالة كل الجلد من الطرف الخلفي.

قطع الرباط المفصلي لمفصل الورك الأيمن ومفصل الركبة بالمقص لفصل الطرف الخلفي. ثم اقطع العظم من كلا الطرفين لغمر العظم بالكامل في 4٪ PFA. قطع المدور وتقاطع الشظية.

اغمر الطرف الخلفي في 4٪ PFA ، مع الحفاظ على الطرف الخلفي الأيمن لتقسيم البارافين. قطع الأربطة المفصلية لمفاصل الورك والركبة اليسرى بالمقص وإزالة الأنسجة الرخوة برفق. افصل الظنبوب وعظم الفخذ واغمرهما بشكل منفصل في 75٪ من الإيثانول.

احتفظ بعظم الفخذ للمسح المقطعي المحوسب الدقيق والظنبوب للكالسيين والأليزارين الأحمر المزدوج. لتحضير أقسام البارافين ، اغسل الطرف الخلفي الأيمن الثابت برفق ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 10 دقائق لكل غسلة. ثم قم بإزالة الكلس في 15٪ EDTA باستخدام مزيل الكلس بالموجات فوق الصوتية لمدة ثلاثة إلى أربعة أسابيع حتى يمكن ثني العظام ، واستبدال السائل المزيل للكلس كل يومين.

بعد إزالة الكلس ، اغسل العينات ثلاث مرات باستخدام PBS واغمرها في 75٪ من الإيثانول عند أربع درجات مئوية طوال الليل. في اليوم الثاني ، اغمر العينات بالتتابع في 95٪ من الإيثانول و 100٪ الإيثانول والزيلين لمدة ساعة واحدة لكل منهما. اغمر العينات في نصف زيلين ونصف بارافين لمدة 30 دقيقة ، ثم في البارافين عند 65 درجة مئوية طوال الليل.

لتضمين العينة ، اغمرها في البارافين ، ووضع عظم الفخذ والساق بزاوية 90 درجة. عندما يبرد البارافين تماما ، قم بإزالة العينات من خزان التضمين. ترقيمها وتخزينها عند سالب 20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

اخبزي أقسام البارافين على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، ثم أزيلي الشمع عن طريق غمرها في الزيلين لمدة 10 دقائق. اغمر الأقسام ثلاث مرات مع الزيلين الطازج في كل مرة. أعد ترطيب الأقسام عن طريق غمرها بالتتابع في 100٪ إيثانول و 95٪ إيثانول و 70٪ إيثانول وماء مقطر لمدة خمس دقائق لكل منهما.

قم بإعداد محلول التلوين باستخدام مجموعة تلطيخ TRAP وقم بتسخينه إلى 37 درجة مئوية. أضف 50 إلى 100 ميكرولتر من محلول التلوين إلى كل قسم واحتضنها في غرفة رطبة 37 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة. تحقق من حالة تلطيخ ناقضات العظم تحت مجهر ضوئي كل خمس دقائق حتى يمكن رؤية ناقضات العظم الحمراء متعددة النوى.

ثم قم بإنهاء التفاعل بالماء. قم بتغطية الأقسام في محلول الهيماتوكسيلين لمدة 30 ثانية وإنشاء لون أزرق ثابت عن طريق غمرها في محلول الأمونيا بنسبة 1٪ لمدة دقيقة واحدة. ثم اشطفها بماء الصنبور الجاري ببطء.

قم بتركيب الأقسام باستخدام زلات الغطاء مع البلسم المحايد وجففها طوال الليل. التقط ثلاثة إلى خمسة مجالات رؤية باستخدام المجهر وحلل المحيط التربيقي باستخدام الصورة J. استخدم أداة الخط المستقيم لقياس طول شريط المقياس ك L1. ثم استخدم أداة الخط المجزأ لقياس طول المحيط التربيقي ك L2. احسب الطول المادي واحسب عدد الخلايا الإيجابية ل TRAP التي تحتوي على أكثر من ثلاث نوى. بعد التثبيت ، اغسل الظنبوب برفق ثلاث مرات باستخدام PBS واغمر العينات بالتتابع في 95٪ من الإيثانول و 100٪ الإيثانول والزيلين لمدة خمس دقائق لكل منهما.

اغمر العينات في الأسيتون لمدة 12 ساعة ونصف أسيتون ونصف راتنج لمدة ساعتين ، وفي الراتنج النقي في فرن التجفيف طوال الليل. أضف الراتنج النقي إلى خزان تضمين هلام السيليكا المناسب وضع العينات في الخزان لتجنب الفقاعات. بلمرة الراتنج في فرن تجفيف على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.

قم بتقطيع العينات إلى أقسام بسمك خمسة ميكرومتر بشكل مستمر باستخدام ميكروتوم دوار وقم بتخزين باقي العينات بالمجفف في درجة حرارة الغرفة. قم بلصق الأقسام بالملاقط في قطرة 75٪ من الإيثانول وقم بتثبيتها بزلات غطاء باستخدام بلسم محايد. التقط الملصقات الفلورية باللونين الأحمر والأخضر باستخدام مجهر فلوري.

تم إنشاء فئران حذف Stat3 الخاصة بناقضات العظم لدراسة تأثير حذف Stat3 على تمايز ناقضات العظم. أشار إعادة بناء الفخذ والتحليل الكمي بواسطة التصوير المقطعي المحوسب الصغير إلى أن كتلة عظام الفئران Stat3 Ctsk قد زادت مقارنة بالفئران البرية. تم فحص التشكل النسيجي لعظم الفخذ من النوع البري والفئران Stat3 Ctsk عن طريق تلطيخ H و E.

تم الكشف عن نشاط العظم باستخدام تلطيخ TRAP. ناقضات العظم هي خلايا كبيرة موجبة TRAP ذات نوى متعددة. كان عدد ناقضات العظم الإيجابية ل TRAP أقل في الفئران Stat3 Ctsk ، مقارنة بالفئران البرية ، مما يشير إلى أن نقص Stat3 يضعف تكوين ناقضات العظم.

تم قياس تكوين العظم باستخدام الملصقات المزدوجة باللون الأحمر الكالسين والأيزارين. تمثل المنطقة الواقعة بين الكالسين والتألق الأحمر الأيزارين عظما تم تشكيله حديثا. لم يؤثر Stat3 المحذوف في ناقضات العظم على ابتناء العظام.

أقسام البارافين السهمية التي كان فيها الغضروف لاحقا متماثلا وأظهر ذلك أنه تم استخدام خط واضح على شكل حرف M هنا. بالنسبة للدراسات، سندرج المزيد من خصائص الجهاز الهيكلي، مثل الخواص الميكانيكية.