إعداد الأنسجة وتلطيخ المناعة من أنسجة الفئران القحفية والعظام غير الصائق

هنا، نقدم بروتوكول مفصل للكشف عن وقياس مستويات البروتين أثناء تكوين الجمجمة والوجه / مسببات الأمراض عن طريق التلطيخ المناعي باستخدام أنسجة الجمجمة والوجه الماوس كأمثلة. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا نصف طريقة لإعداد واستئصال التبريد من الأنسجة الصلبة undecalcified من الفئران الشباب لتلطيخ المناعة.

هنا، نقدم لدينا بروتوكول بسيط للكشف المناعي للكشف عن البروتينات على المواد المقطعة. لا يتطلب هذا الأسلوب استرداد antigen. سوف نستخدم رؤوس الماوس، بما في ذلك الأنسجة الصلبة غير محسوبة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي تخطي استرجاع المستضد و إلغاء الأنسجة الصلبة. تلك تؤدي إلى نوعية جيدة من نتائج المناعة. هذا الأسلوب أيضا يوفر كل من الوقت والعمل.

هذه الطريقة هي أيضاً قابلة للتطبيق على الأنسجة الأخرى مع التعديلات المناسبة. لجعل أقسام لطيفة من الأنسجة غير معايرة، تشريح الأنسجة المستهدفة الخاصة بك كذلك لتقليم الأنسجة المحيطة بها، وإذا لزم الأمر علاج العينات مع 10٪ EDTA في أربع درجات مئوية لمدة يومين قبل cryoprotection. مظاهرة بصرية يوفر شرحاً تفصيلياً ووضوحاً لإجراء هذا الأسلوب.

للبدء ، وإعداد واحد 10 سنتيمترا وعدة أطباق 3.5 سنتيمتر تحتوي على برنامج تلفزيوني ولوحة ثقافة واحدة 12 بئرا تحتوي على ملليلترين من 4 ٪ PFA في PBS في كل بئر لكل فأرة حامل ، ووضعها جميعا على الجليد. لتشريح الأجنة من الفئران الحامل، والاستيلاء على الجلد تحت وسط بطن فأر القتل الرحيم مع ملقط، وقطع من خلال الجلد فقط، ومن ثم سحب بلطف في الجلد لفصله عن جدار العضلات البطنية الكامنة. بعد نفس الخط من شق الجلد، وقطع في تجويف البطن.

إزالة الرحم الذي يحتوي على سلسلة من الأجنة. ثم، إزالة الأجنة عن طريق قطع بلطف بعيدا جدار الرحم، والتي سوف إزالة الأنسجة خارج المقصف مثل كيس صفار والرنين. قطع وعزل الرأس عن كل جنين، ومع ملقط نقل كل رأس في بئر منفصلة من 12-جيدا لوحة تحتوي على 4٪ PFA.

احتضان في أربع درجات مئوية لمدة أربع ساعات لإصلاح. شطف رؤساء في برنامج تلفزيوني في أربع درجات مئوية مع اهتزاز لطيف لمدة 12 ساعة. للتبريد رؤساء، ونقلها باستخدام ملقط في لوحة جديدة 12-جيدا تحتوي على مليلتر اثنين من 30٪ السكروز في برنامج تلفزيوني.

احتضان مع التحريض لطيف في أربع درجات مئوية حتى تغرق الرؤوس إلى أسفل الطبق. لتضمين رؤساء المبردات، ونقلها إلى قالب يحتوي على مركب درجة حرارة القطع الأمثل، وتكسير لعدة دقائق. باستخدام ملقط، وضبط موقع واتجاه العينات بحيث يواجه الجانب المشذب من العينات الجزء السفلي من القالب التضمين.

ثم، ضع القالب على الثلج الجاف لتجميد، وتخزينها في كيس من البلاستيك في ناقص 80 درجة مئوية حتى جاهزة للتبريد. بالنسبة للأنسجة بعد الولادة ، بعد إزالة الجلد والأنسجة الدهنية من فأر القتل الرحيم ، من ثلاثة أسابيع إلى ثلاثة أشهر ، قم بقطع الرأس وعزله وإزالة الفك السفلي. ثم، إصلاح و cryoprotect الرأس كما فعلت مع رؤساء الأجنة.

تضمين في الجيلاتين 8٪ بطريقة مماثلة لرؤساء الأجنة في أكتوبر، والحفاظ على Cryomolds في كيس من البلاستيك في ناقص 80 درجة مئوية حتى التبريد. تعيين درجة الحرارة التبريد المناسبة. ضع العينات في غرفة التبريد لمدة 30 دقيقة لتكواد درجة حرارة التبريد.

إزالة كتلة مع العينة من Cryomold، وجبل مع قطرة أكتوبر على تشاك العينة وتجميد ذلك، مع التأكد من الحفاظ على الجانب المشذب من العينة أبعد من تشاك وتواجه المشغل. قم بتحميل chuck المثبتة على الكتلة على حامل كائن التبريد. اضبط حامل النصل بحيث تكون زاوية النصل من 3 إلى 5 درجات بالنسبة للعينة.

جمع 10 ميكرومتر المقاطع على شرائح المجهر المغلفة. اترك الأقسام في درجة حرارة الغرفة حتى تجف تمامًا ، ثم قم بتخزينها عند درجة حرارة 80 درجة مئوية. لتبدأ مع تلطيخ، إخراج الشرائح من ناقص 80 درجة مئوية، والاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة لتجفيف الهواء المقاطع.

شطف الشرائح في 0.1٪PBST ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل من غسل أكتوبر و permeabilize المقاطع. أضف 200 ميكرولترات من محلول الحجب لكل شريحة، وحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ثم قم بإزالة الحل حظر دون شطف الشريحة.

إضافة 100 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية المخففة في حل منع لكل شريحة، واحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. شطف الشرائح مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل درجة حرارة الغرفة. إضافة 100 ميكرولترات من الأجسام المضادة الثانوية المخففة في محلول الحجب، واحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء.

شطف في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل درجة حرارة الغرفة، لا تزال محمية من الضوء. لتحميل الشرائح، أضف قطرتين من الوسيلة المضادة للتلاشي مع DAPI على كل شريحة، وغطيها بغطاء، واخزنها عند أربع درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للصورة. كانت العظام الأمامية للأجنة التحكم إيجابية بالنسبة لـ pSmad1/5/9 ، وعوامل إشارات BMP في المصب ، وKi67 ، وهي علامة انتشار الخلايا.

في قمة خاصة العصبية، تنشيطها بشكل مكوّن BMPR1A الأجنة المتحولة، ومع ذلك، تم زيادة مستويات pSmad1/5/9 في حين انخفضت مستويات Ki67. وعلاوة على ذلك، لوحظت خلايا اpoptotic أكثر في العظام الأمامية من الأجنة متحولة من تلك الأجنة السيطرة. تظهر الشظايا الكارنية من الرؤوس المضمنة من الجيلاتين إشارة GFP وإشارة RFP من كاسيت tdTomato في عظم الأنف والأنسجة الأنفية، مما يدل على أن الجيلاتين لا يتداخل مع الإشارات الفلورية.

عندما كانت هذه الأجزاء مُعَطَدة مناعية لـ SOX9 أو Osterix و E11/Podoplanin ، تم الحصول على أقسام ذات نوعية جيدة من معظم الأنسجة الصلبة لمدة ثلاثة أسابيع. من ناحية أخرى، مع عينات عمرها ثلاثة أشهر، تم الحصول على أقسام ذات نوعية جيدة فقط في بعض الأنسجة الصلبة، بما في ذلك مقصورات الجراب من عظم الفخذ، والأنسجة الأنفية، والجمجمة، بما في ذلك خياطة الأنف قبل التاكسف والعظام المحيطة بالرأس. تم الكشف عن الخلايا الإيجابية SOX9 على وجه التحديد في شوكندروسيات من لوحة النمو والمفاصل من عظم الفخذ و الحاجز الأنفي.

في القاطع البالغ من العمر ثلاثة أسابيع ، تم الكشف عن SOX9 في الخلايا المتوسطة. تظهر نتائج التلطيخ المزدوجة أوستريكس و E11 أن أوستريكس تم اكتشافه في العظام، في حين تم اكتشاف E11 في عظام العظام من عظم الفخذ والرأس. في الفاصل لمدة ثلاثة أسابيع ، كان أوستريكس إيجابيًا في odontoblasts ، في حين كان E11 إيجابيًا في الخلايا المتوسطة المسامية.

يرجى عدم الإفراط في العينات مع 4٪ PFA. بالنسبة لشريحة الأنسجة الصلبة غير المعايرة في الجيلاتين ، فإن أفضل درجة حرارة هي ناقص 25 درجة مئوية وأقل. وبعد هذا الإجراء، يمكن تحديد مستويات الفلوريسين كمياً كما هو موضح في بروتوكولنا.

وستوفر هذه القياسات بيانات مفيدة تبين الفرق في المستوى النسبي للبروتين بين المجموعات المختلفة. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق لتلطيخ مزدوج أو ثلاثي للحصول على أنماط التعبير المشترك للبروتينات المختلفة. 4٪ PFA خطرة.

قد يسبب حساسية الجلد، وتلف العين خطيرة، والأضرار الأعضاء، أو السرطان. يرجى استخدام معدات الحماية الشخصية، وغسل الجلد جيدا بعد المناولة.