خالية من التسمية تدفق عمل البروتوميات الكمية للتفاعلات المُضيفة-الممرضة مدفوعة بالإكتشاف
أكتوبر 20, 2020
هنا، نقدم بروتوكولاً لتقديم لمحة عن التفاعل بين المضيف والممرض أثناء الإصابة بالبروتيوميات المستندة إلى الطيف الكتلي. يستخدم هذا البروتوكول تحديد كمي خال من التسمية لقياس التغيرات في وفرة البروتين لكل من المضيف (على سبيل المثال، الضامة) والعوامل الممرضة (مثل Cryptococcus neoformans)في تجربة واحدة.
يبحث بروتوكولنا في العدوى الفطرية من منظور المضيف وممرض الأمراض لتحديد التفاعلات بين الأنظمة البيولوجية الضرورية للمرض. يمكننا اكتشاف كل من البروتينات الفطرية والمضيفة في تجربة واحدة وتحديد البروتينات الفطرية التي يتم إنتاجها فقط أثناء الإصابة ، والتي تمثل بروتينات جديدة مرتبطة بالعدوى. على الرغم من أننا نركز على علاج الالتهابات الفطرية من خلال الكشف عن استراتيجيات جديدة مضادة للضراوة للعلاج ، إلا أن خط أنابيب البروتينات والمعلوماتية الحيوية لدينا عالمي ويمكن تطبيقه على العديد من الأنظمة البيولوجية.
يضع نهجنا الأساس لدراسات مسببات الأمراض المختلفة والعديد من الاستجابات المناعية ويمكن استخدامه لتقديم رؤى جديدة حول العلاقة بين المكورات المشفرة والجهاز المناعي الفطري. من المهم استجابة البلاعم لمسببات الأمراض واكتشاف ما يكفي من البروتينات الفطرية. لذلك يوصى باختبار وتحسين سبل التنفيذ والنقاط الزمنية لكل نوع.
نظرا لأن البلاعم وزراعة الخلايا الفطرية يمكن أن تكون صعبة ، فإن معرفة ما يمكن توقعه بعد الزراعة المشتركة أمر مهم. يوفر التصور للباحث الثقة في تنفيذ الإجراء. لتحضير الخلايا الفطرية لعدوى البلاعم ، قم بجمع خلايا C neoformans والطرد المركزي من مزرعة متوسطة الطور الطويلة ، متبوعة بثلاث غسلات لطيفة مع ملليلتر واحد من PBS بدرجة حرارة الغرفة في نفس ظروف أجهزة الطرد المركزي.
بعد الغسيل الأخير ، قم بتعليق الخلايا الفطرية عند 1.2 مرة من 10 إلى خلايا ثامنة لكل مليلتر من زراعة الخلايا الخالية من المضادات الحيوية ، بتركيز متوسط وأضف ملليلترا واحدا من تعليق الخلايا الفطرية إلى كل من الآبار الأربعة من 70٪ إلى 80٪ لوحة ثقافة البلاعم الملتصقة ستة آبار. ثم ضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا لمدة ثلاث ساعات. قم بإمالة اللوحة بعناية للسماح بغسل كل بئر برفق ثلاث مرات باستخدام مليلتر واحد من PBS لكل بئر لكل غسلة.
لقياس كفاءة العدوى بعد الغسيل الأخير ، أضف ملليلترا واحدا من الوسط الخالي من المضادات الحيوية إلى كل بئر من لوحة الآبار الستة ، وضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا. في النقاط الزمنية التجريبية المناسبة ، اجمع المادة الطافية من كل بئر وقم بقياس كمية LDH في كل بئر وفقا للبروتوكولات القياسية. في نفس النقاط الزمنية ، قم بتحليل خلايا البلاعم غير المصابة لتحديد قيمة أقصى قدر من السمية الخلوية.
يمكن بعد ذلك حساب السمية الخلوية باستخدام الصيغة كما هو موضح. لجمع البلاعم غير المصابة والزراعة المشتركة ، أضف ملليلترا واحدا من PBS البارد إلى كل بئر من البلاعم غير المصابة. بعد دقيقة واحدة ، اضغط برفق على اللوحة لفصل الخلايا عن قيعان الآبار وتجميع معلقات الخلية في أنبوب واحد سعة 15 مل.
اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وقم بإزالة المادة الطافية تماما للسماح بالتجميد الفوري للحبيبات في النيتروجين السائل للتخزين بدرجة 80 درجة تحت الصفر. يكشف تحليل المكون الرئيسي للعملية إلى مجموعات البيانات أنه ، كما هو متوقع ، فإن أكبر عنصر للفصل بين البيانات هو العينات المصابة مقابل العينات غير المصابة. السمة المميزة الثانية للعينات هي تنوعها البيولوجي.
يظهر الجمع بين ارتباط بيرسون والتجميع الهرمي بواسطة المسافة الإقليدية تجميعا مميزا للعينات المصابة مقابل العينات غير المصابة مع قابلية تكرار تتراوح من 95٪ إلى 96٪ اختبار الطلاب المصحح لاختبار الفرضيات المتعددة باستخدام معدل الاكتشاف الخاطئ Benjamini-Hochberg لتحديد البروتينات ذات الاختلافات الكبيرة في الوفرة أثناء الإصابة مقارنة بالضوابط غير المصابة. في هذا التحليل ، تم تحديد 117 بروتين مضيفا يظهر تغيرا كبيرا في التعبير عند الإصابة. والجدير بالذكر أنه لوحظت أيضا زيادات كبيرة في وفرة البروتينات الفطرية ، كما هو متوقع أثناء الإصابة.
من المهم التعامل مع البلاعم برفق أثناء التثقيف والغسيل وجمع العينات. من خلال تحديد كيفية تكيف العامل الممرض مع المضيف وكيف يدافع المضيف عن نفسه من العدوى ، يتم اكتساب رؤى جديدة في مجالات علم الأحياء الدقيقة وعلم المناعة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يستقصي هذا البروتوكول التفاعل بين المضيف والممرض أثناء العدوى الفطرية باستخدام التحليل البروتيني القائم على مطيافية الكتلة. وهو يتيح الكشف عن بروتينات المضيف والممرض معاً في تجربة واحدة، مما يوفر رؤى حول البروتينات المرتبطة بالعدوى.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علوم الأعصاب
- الأمراض المعدية
- البروتوميات
خلفية علمية
- يُعد فهم التفاعلات بين المضيف ومسبب المرض أمراً بالغ الأهمية لأبحاث الأمراض.
- تشكل العدوى الفطرية مخاطر صحية كبيرة، مما يستلزم استراتيجيات علاجية مبتكرة.
- يمكن لعلم البروتوميات الكشف عن التغيرات في وفرة البروتين أثناء العدوى.
- تلعب الخلايا البلعمية دوراً رئيسياً في الاستجابة المناعية لمسببات المرض.
الغرض من الدراسة
- لتوصيف التفاعلات بين البلاعم المضيفة وممرض Cryptococcus neoformans.
- لتحديد بروتينات جديدة مرتبطة بالعدوى يتم إنتاجها أثناء العدوى الفطرية.
- لإنشاء مسار عمل شامل للبروتوميات والمعلوماتية الحيوية قابل للتطبيق على أنظمة بيولوجية متنوعة.
الطرق المستخدمة
- البروتوميات القائمة على قياس الطيف الكتلي للكشف عن البروتينات.
- الكميّة الخالية من الوسوم لقياس التغيرات في وفرة البروتين.
- تحسين تعدد العدوى (MOI) والنقاط الزمنية للحصول على نتائج دقيقة.
- تحليل المعلوماتية الحيوية لتفسير بيانات البروتوميات.
النتائج الرئيسية
- تحديد البروتينات الفطرية التي يتم إنتاجها خصيصاً أثناء العدوى.
- الحصول على رؤى حول استجابة الخلايا البلعمية لـ Cryptococcus neoformans.
- إنشاء إطار عمل لدراسة مسببات الأمراض المختلفة والاستجابات المناعية.
- إثبات قابلية تطبيق البروتوكول على أنظمة بيولوجية مختلفة.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول نهجاً شاملاً لدراسة التفاعلات بين المضيف والمسبب المرضي.
- يضع هذا البروتوكول الأساس للأبحاث المستقبلية حول العدوى الفطرية والاستجابات المناعية.
- يُنصح بإجراء المزيد من التحسينات على الظروف التجريبية لمختلف الأنواع.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في الصناعة
يتيح سير عمل البروتوميات الكمية الخالية من الوسوم هذا التوصيف المتزامن لبروتومات العائل والممرض أثناء العدوى، مما يوفر بيانات غير متحيزة عن وفرة البروتين، وهي بيانات بالغة الأهمية للتحقق من الأهداف في أبحاث الأمراض المعدية. ومن خلال تحديد البروتينات الفطرية المرتبطة بالعدوى وبصمات استجابة العائل، تدعم هذه الطريقة تقليل المخاطر الميكانيكية لاستراتيجيات مكافحة الضراوة وتوجه عملية اختيار الأهداف في المرحلة قبل السريرية. كما أن قابليتها للنقل عبر أنظمة العائل والممرض تعزز إمكانية تطبيقها على نطاق المحفظة البحثية لبرامج اكتشاف مضادات الفطريات والمعدلات المناعية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال تحديد بروتينات الممرض التي يتم إنتاجها حصرياً أثناء العدوى، مما يمثل أهدافاً جديدة مرتبطة بالضراوة.
- القيمة العلمية: توضح مسارات التفاعل بين المضيف والممرض من خلال التغيرات المترابطة في الوفرة في كلا البروتينومين، مما يدعم التحقق الوظيفي من الأهداف.
- القيمة العلمية: تقلل من الغموض الميكانيكي من خلال توفير ملفات بروتومية كمية وقابلة للتكرار لحالة العدوى لتقليل المخاطر المرتبطة بفرضيات الأهداف.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة التشغيلية: تجهيز أنظمة بيولوجية مُصادق عليها (خلايا بلعمية مصابة) لتطوير المقايسات اللاحقة من خلال توحيد ظروف العدوى وتحسين تعددية العدوى (MOI).
- القيمة التشغيلية: توليد مخرجات بروتومية كمية وخالية من الوسوم، صالحة لتوحيد المقايسات وتقييم قابلية التكرار في حملات الفحص.
- القيمة التشغيلية: دعم إعادة استخدام المنصة القابلة للتوسع عبر مسببات أمراض متنوعة بفضل التصميم الشامل لمسار تحليل البروتوميات والمعلوماتية الحيوية.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- القيمة الانتقالية: تحديد بروتينات المضيف ذات الصلة بالمرض والتي تستجيب للغزو الميكروبي، مما يتيح مواءمة المؤشرات الحيوية للتحقق من الصحة في المرحلة ما قبل السريرية.
- القيمة الانتقالية: ضمان الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى العمل ما قبل السريري من خلال ربط التحولات البروتومية في حالة العدوى بالآليات الممرضة.
- القيمة الانتقالية: توجيه قرارات التقدم المعدلة حسب المخاطر من خلال تسليط الضوء على البروتينات الأساسية للفوعة وآليات دفاع المضيف.
تكامل سير العمل والمسارات التحليلية
يتكامل مسار العمل هذا في مراحل البيولوجيا الاستكشافية المبكرة من خلال تحليل ملفات تفاعل المضيف والممرض، ويدعم الجاهزية للفحص عبر نماذج عدوى موحدة، كما يتيح البحث الانتقالي من خلال ربط التغيرات البروتينية بآليات الفوعة والاستجابة المناعية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات من خلال قياس التغيرات الناجمة عن العدوى في بروتينات مسببات الأمراض والمضيف على حد سواء.
- الفحص: توفر أنظمة بيولوجية جاهزة للمقايسة مع تحسين تعددية العدوى (MOI) والنقاط الزمنية، مما يضمن نماذج عدوى قابلة للتكرار لتقييم المركبات.
- التحليلات: توفر قياسات كمية خالية من الوسوم ومخرجات إحصائية (مثل اختبارات t المصححة وفق طريقة Benjamini-Hochberg) لمقارنة الظروف وتحديد البروتينات التي تغيرت بشكل ملحوظ.
- الأبحاث الانتقالية: تربط البصمات البروتومية بآليات إمراضية واستجابات دفاع المضيف، مما يدعم اكتشاف المؤشرات الحيوية والاستمرارية في الدراسات قبل السريرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس لمسار عمل في البروتيوميات والمعلوماتية الحيوية قابل لإعادة الاستخدام ويمكن تطبيقه على مسببات أمراض وأجهزة مناعية متعددة، مما يقلل من تكرار تطوير الطرق.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزيز الثقة التنبؤية في التحقق من الأهداف من خلال التوصيف البروتيني الكمي وغير المتحيز لحالة العدوى.
- القيمة التشغيلية: تعزيز القابلية للتكرار والتوحيد القياسي عبر بروتوكولات محسنة للزراعة المشتركة، والغسيل، والتحلل، مع مقاييس مراقبة جودة تم التحقق منها (PCA، والتجميع، وقابلية تكرار بنسبة 95-96%).
- القيمة الاستراتيجية: تحسين قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال الكشف عن عوامل الفوعة الحرجة وشبكات استجابة المضيف، مما يقلل المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة من برامج مضادات الفطريات.
- التأثير على المحفظة: تمكين تحديد أولويات الأهداف المعدلة حسب المخاطر استناداً إلى التعبير البروتيني النوعي للعدوى والمشاركة في المسارات الحيوية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في زراعة الخلايا الثديية والفطرية، وتحضير عينات البروتوميات، وتحليل بيانات مطيافية الكتلة.
- يعتمد على توفر أجهزة LC-MS/MS، وبرمجيات التكميم الخالي من الوسوم، وأدوات المعلوماتية الحيوية لتحليل المكونات الرئيسية (PCA)، والتحليل العنقودي، وتحليل التعبير التفاضلي.
- يستلزم توحيد معايير بارامترات العدوى (MOI، والنقاط الزمنية) ومعالجة العينات بين الفرق لضمان قابلية التكرار عبر الدراسات.
- يتضمن اعتبارات التكييف لأنظمة مختلفة من المسبب المرضي والمضيف، بما في ذلك تحسين تحضير الخلايا الفطرية ودرجة تلاحم الخلايا البلعمية.
- تشمل القيود العملية التحدي التقني المتمثل في الكشف عن البروتينات الفطرية ذات الوفرة المنخفضة وسط إشارات المضيف الخلفية العالية، مما يتطلب عمق عدوى وحساسية كافيين.
