خالية من التسمية تدفق عمل البروتوميات الكمية للتفاعلات المُضيفة-الممرضة مدفوعة بالإكتشاف

هنا، نقدم بروتوكولاً لتقديم لمحة عن التفاعل بين المضيف والممرض أثناء الإصابة بالبروتيوميات المستندة إلى الطيف الكتلي. يستخدم هذا البروتوكول تحديد كمي خال من التسمية لقياس التغيرات في وفرة البروتين لكل من المضيف (على سبيل المثال، الضامة) والعوامل الممرضة (مثل Cryptococcus neoformans)في تجربة واحدة.

يبحث بروتوكولنا في العدوى الفطرية من منظور المضيف وممرض الأمراض لتحديد التفاعلات بين الأنظمة البيولوجية الضرورية للمرض. يمكننا اكتشاف كل من البروتينات الفطرية والمضيفة في تجربة واحدة وتحديد البروتينات الفطرية التي يتم إنتاجها فقط أثناء الإصابة ، والتي تمثل بروتينات جديدة مرتبطة بالعدوى. على الرغم من أننا نركز على علاج الالتهابات الفطرية من خلال الكشف عن استراتيجيات جديدة مضادة للضراوة للعلاج ، إلا أن خط أنابيب البروتينات والمعلوماتية الحيوية لدينا عالمي ويمكن تطبيقه على العديد من الأنظمة البيولوجية.

يضع نهجنا الأساس لدراسات مسببات الأمراض المختلفة والعديد من الاستجابات المناعية ويمكن استخدامه لتقديم رؤى جديدة حول العلاقة بين المكورات المشفرة والجهاز المناعي الفطري. من المهم استجابة البلاعم لمسببات الأمراض واكتشاف ما يكفي من البروتينات الفطرية. لذلك يوصى باختبار وتحسين سبل التنفيذ والنقاط الزمنية لكل نوع.

نظرا لأن البلاعم وزراعة الخلايا الفطرية يمكن أن تكون صعبة ، فإن معرفة ما يمكن توقعه بعد الزراعة المشتركة أمر مهم. يوفر التصور للباحث الثقة في تنفيذ الإجراء. لتحضير الخلايا الفطرية لعدوى البلاعم ، قم بجمع خلايا C neoformans والطرد المركزي من مزرعة متوسطة الطور الطويلة ، متبوعة بثلاث غسلات لطيفة مع ملليلتر واحد من PBS بدرجة حرارة الغرفة في نفس ظروف أجهزة الطرد المركزي.

بعد الغسيل الأخير ، قم بتعليق الخلايا الفطرية عند 1.2 مرة من 10 إلى خلايا ثامنة لكل مليلتر من زراعة الخلايا الخالية من المضادات الحيوية ، بتركيز متوسط وأضف ملليلترا واحدا من تعليق الخلايا الفطرية إلى كل من الآبار الأربعة من 70٪ إلى 80٪ لوحة ثقافة البلاعم الملتصقة ستة آبار. ثم ضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا لمدة ثلاث ساعات. قم بإمالة اللوحة بعناية للسماح بغسل كل بئر برفق ثلاث مرات باستخدام مليلتر واحد من PBS لكل بئر لكل غسلة.

لقياس كفاءة العدوى بعد الغسيل الأخير ، أضف ملليلترا واحدا من الوسط الخالي من المضادات الحيوية إلى كل بئر من لوحة الآبار الستة ، وضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا. في النقاط الزمنية التجريبية المناسبة ، اجمع المادة الطافية من كل بئر وقم بقياس كمية LDH في كل بئر وفقا للبروتوكولات القياسية. في نفس النقاط الزمنية ، قم بتحليل خلايا البلاعم غير المصابة لتحديد قيمة أقصى قدر من السمية الخلوية.

يمكن بعد ذلك حساب السمية الخلوية باستخدام الصيغة كما هو موضح. لجمع البلاعم غير المصابة والزراعة المشتركة ، أضف ملليلترا واحدا من PBS البارد إلى كل بئر من البلاعم غير المصابة. بعد دقيقة واحدة ، اضغط برفق على اللوحة لفصل الخلايا عن قيعان الآبار وتجميع معلقات الخلية في أنبوب واحد سعة 15 مل.

اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وقم بإزالة المادة الطافية تماما للسماح بالتجميد الفوري للحبيبات في النيتروجين السائل للتخزين بدرجة 80 درجة تحت الصفر. يكشف تحليل المكون الرئيسي للعملية إلى مجموعات البيانات أنه ، كما هو متوقع ، فإن أكبر عنصر للفصل بين البيانات هو العينات المصابة مقابل العينات غير المصابة. السمة المميزة الثانية للعينات هي تنوعها البيولوجي.

يظهر الجمع بين ارتباط بيرسون والتجميع الهرمي بواسطة المسافة الإقليدية تجميعا مميزا للعينات المصابة مقابل العينات غير المصابة مع قابلية تكرار تتراوح من 95٪ إلى 96٪ اختبار الطلاب المصحح لاختبار الفرضيات المتعددة باستخدام معدل الاكتشاف الخاطئ Benjamini-Hochberg لتحديد البروتينات ذات الاختلافات الكبيرة في الوفرة أثناء الإصابة مقارنة بالضوابط غير المصابة. في هذا التحليل ، تم تحديد 117 بروتين مضيفا يظهر تغيرا كبيرا في التعبير عند الإصابة. والجدير بالذكر أنه لوحظت أيضا زيادات كبيرة في وفرة البروتينات الفطرية ، كما هو متوقع أثناء الإصابة.

من المهم التعامل مع البلاعم برفق أثناء التثقيف والغسيل وجمع العينات. من خلال تحديد كيفية تكيف العامل الممرض مع المضيف وكيف يدافع المضيف عن نفسه من العدوى ، يتم اكتساب رؤى جديدة في مجالات علم الأحياء الدقيقة وعلم المناعة.