استخدام اعتراض البصرية لدراسة التفاعلات المرضي المضيف الحيوي للخلية الحية التصوير

الهدف العام من التجربة التالية هو استخدام الاصطياد البصري جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري متحد البؤر للقرص الدوار لمراقبة تفاعلات مسببات الأمراض المضيفة في الوقت الفعلي. يتم تحقيق ذلك عن طريق إضافة مسببات الأمراض ذات الأهمية أولا إلى زجاج غطاء حجرة. بعد ذلك ، يتم تحديد الجسيم والتقاطه باستخدام المصيدة البصرية.

أخيرا ، يتم توجيه الجسيم إلى الخلية محل الاهتمام. كما هو موضح هنا. يمكن أن يكون الاصطياد البصري طريقة فعالة للتحكم في جسيمين لمراقبة التفاعلات الديناميكية داخل الخلايا.

يمكن أن تجيب هذه الطريقة على أسئلة مهمة في تفاعلات مسببات الأمراض المضيفة في مجالات الأمراض المعدية والمناعة ، بما في ذلك ما هو تأثير البلعمة عند الحصول على التحكم الكامل في العلاقات المكانية بين الخلايا المضيفة ومسببات الأمراض ، وكذلك ما إذا كان ترتيب مسببات الأمراض التي تمتصها الخلية البلعمية يؤثر على النضج الجسدي للبلعمة. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنه يجب تحسين ظروف الاصطياد لأنواع مختلفة من الخلايا والخرز. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية كعملية إعداد ودمج قرص دوارة.

يصعب تصور كونبؤر المصيدة البصرية بسبب المحاذاة الدقيقة الضرورية لجميع المكونات البصرية. حصاد العامل الممرض محل الاهتمام. على سبيل المثال ، هنا ، تتم إزالة 300 ميكرولتر من ألبكان كندا المزروع بين عشية وضحاها في المرق من الثقافة ونقل مسببات الأمراض إلى أنبوب تفاعل سعة 1.5 ملليلتر.

ثم اغسل مسببات الأمراض ثلاث مرات عند حوالي 1300 Gs لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، مع شفط المادة الطافية وترك الحبيبات دون إزعاج في كل مرة يتم فيها تعليق PBS والصوتنة. بعد الغسيل الثالث ، قم بتعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من PBS. بعد ذلك ، قم بإذابة ملليغرام واحد من صبغة العهدة في 100 ميكرولتر من ثنائي ميثيل فورماميد للحصول على تركيز نهائي يبلغ 10 ملليغرام لكل مليلتر.

ثم أضف ثلاثة ميكرولترات من خليط الصبغة إلى أنبوب التفاعل الذي يحتوي على مسببات الأمراض المغسولة. ضع ورق القصدير حول الأنابيب لأن الأصباغ حساسة للضوء ورج العينة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، ثم قم بالحبيبات وغسل العينة في PB S3 مرات كما كان من قبل. أعد تعليق الحبيبات في 300 ميكرولتر من PBS بعد الغسيل الأخير.

تسخين الوسائط و PVS إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي اغسل. صفيحة زراعة الأنسجة مقاس 10 سم مطلية ب 2 6 4 0.7 ضامة خام مرتين مع PBS ، يستنشق PBS بين كل غسلة. بعد ذلك ، قم بتغطية سطح اللوحة بخمسة ملليلتر من التربسين واحتضان اللوحة لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية.

ثم اطرق جانب اللوحة برفق لفصل الخلايا عن سطح اللوحة. الحرص على عدم رش التربسين خارج اللوحة. أضف الآن خمسة ملليلتر من الوسائط إلى اللوحة وانقل الخليط إلى أنبوب التفاعل.

بعد التكوير, تستنشق الخلايا الوسائط مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات وإعادة تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من الوسائط. أضف 400 ميكرولتر من الوسائط إلى كل غرفة في شريحة الغرفة ، ثم أضف خمسة ميكرولترات من تعليق الخلية إلى كل غرفة. اسمح للخلايا بالنمو طوال الليل في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

استرجع شريحة الغرفة من ماصة الحاضنة من خمسة إلى 10 ميكرولترات من مسببات الأمراض ذات الأهمية الفلورية المعدة مسبقا في كل غرفة من الضامة. امزج البلاعم ومسببات الأمراض جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل ، مع الحرص على عدم لمس قاع الغرفة وإزعاج البلاعم الملتصقة. قم بتشغيل جميع مكونات المجهر متحد البؤر للقرص الدوار.

قم بإعداد المجهر عن طريق إضافة الزيت إلى العدسة الموضوعية الغمر بالزيت. أدخل شريحة الغرفة في المرحلة المتخصصة ثم قم بإزالة الجزء العلوي من مجهر محاذاة شريحة الغرفة لتصوير DIC. قم بتشغيل الغالق للمصيدة البصرية وليزر الأشعة تحت الحمراء.

ثم افتح الغالق الموجود على الليزر إلى المصيدة البصرية. تأكد من إغلاق الغالق الموجود أمام ليزر الأشعة تحت الحمراء عن طريق التحقق باستخدام بطاقة الأشعة تحت الحمراء. ركز الآن على البلاعم على الشريحة الملتصقة.

ثم ابحث عن مسببات الأمراض التي تطفو بحرية في المحلول المجاور للضامة. أصعب جزء في هذا الإجراء هو العثور على الكائن المناسب لتتبعه في غرفة العينة بسبب قوى الالتصاق بين الجسم وزجاج الغطاء في غرفة العينة. من أجل تحريك هذا الكائن ، يجب عليك تحريك المرحلة أثناء تثبيت الكائن بواسطة ليزر المرور ، ومن المهم أيضا ملاحظة أنه يجب عليك تحريك المرحلة بمكان بطيء بما فيه الكفاية بحيث لا تتجاوز قوة السحب للمرحلة أقصى قوة محاصرة بواسطة المصائد.

حرك المرحلة بحيث يكون العامل الممرض بالقرب من المصيدة. ثم افتح الغالق وقم بإشراك المصيدة. حرك العينة لجعل البلاعم على اتصال صورة مسببات الأمراض المحاصرة الثابتة.

تم تصنيف مسببات الأمراض ذات المجهر متحد البؤر القرص الدوار إما في مضان DIC أو مزيج من كلا المجموعتين المنفصلتين من البيض الكندي ، والتي يبلغ حجمها عادة حوالي خمسة ميكرون ، باللون الأخضر والأزرق والأحمر. لتوضيح التصوير ، تم محاصرة C albicans وحركها في نمط مربع من خلال مجموعة من الخميرة الأخرى كما هو موضح في الأسهم الرمادية ، مما يدل على القدرة على التقاط ومعالجة الموقع المحدد لمسببات الأمراض الفردية التي يختارها المشغل حتى في بيئة مزدحمة. لتوضيح مرونة هذا النظام بشكل أكبر لاحتجاز أشكال الأشكال المختلفة التي تظهرها الكائنات المسببة للأمراض في هذا الشكل ، تم استخدام الملقط البصري لتثبيت ووضع جسيم C albicans مع hyphy زائف.

يتم تصنيف C albicans بصبغة حمراء ويتم تحريكه على طول مسار كما هو موضح في السهم الأبيض ويوضع بجوار الخلايا الخام الفلورية GFPL C3. باللون الأخضر. تم محاصرة جزء الخميرة من الألبيكانس مع تأخر الغطاء الزائف.

وضع آلهة الرشاشيات أيضا بجوار خلية ضامة الفئران الخام من أجل تحليل الإطار الزمني المطلق للبلعمة مع هذا الخط الخلوي المحدد وممرض الأمراض. في هذا الشكل ، تظهر صور الحقول الساطعة كيف تم تحريك الرشاشيات المحاصرة ، كما هو موضح في السهم الأبيض ، ووضعها على طول المسار كما هو موضح بالسهم الأحمر. يكون العامل الممرض المحاصر بعيدا قليلا عن التركيز بسبب المصيدة التي تدفع الكائن الحي فوق المستوى البؤري قليلا.

تم نقل الرشاشيات حتى تم وضعها بجوار الخلية الخام المرغوبة. بمجرد أن يتلامس العامل الممرض مع الخلية ، تم إيقاف تشغيل المصيدة. تم تنشيط عملية البلعمة وتم استخدام التصوير بفاصل زمني لمراقبة الأحداث الخلوية اللاحقة.

في 30 ثانية ، بدأ غشاء الخلية الخام في التغير وتشكيل كوب حول الجسيم. في 60 ثانية ، تم تشكيل الكأس بالكامل. من 90 ثانية إلى 150 ثانية ، أصبح Afu Gotti وابتلع ، وبحلول 180 ثانية تم استيعاب الجسيم بالكامل.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء جهاز مصيدة بصرية للقرص الدوار ، وكيف يمكن لمثل هذه الأداة أن تمكن المرء من التحكم بشكل غير جراحي في مسببات الأمراض لتصوير الخلايا الحية بعد تطويرها. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تفاعلات مسببات الأمراض المضيفة للتحقيق في دور العلاقات المكانية بين الخلايا المضيفة ومسببات الأمراض ، ودورها في الاستجابة المناعية التي تلت ذلك.